人外周血淋巴细胞分离液的应用

背景^[1-3]

人外周血淋巴细胞分离液是一种用于分离外周血中淋巴细胞的溶液。它通常包含葡聚糖（右旋糖酐）和泛影酸葡甲胺等成分，能够使淋巴细胞在密度梯度离心时浮在密度介于血液和淋巴细胞分离液之间的界面，从而将其与红细胞、血小板等其他细胞成分分离。

人外周血淋巴细胞分离液主要用于免疫学检测和体外细胞培养等实验中，以获取足够数量的淋巴细胞用于后续的研究和应用。由于淋巴细胞是免疫系统中的重要组成部分，因此这种分离液在研究免疫应答、疫苗开发、肿瘤免疫治疗等方面也有着广泛的应用。

人外周血淋巴细胞分离液

人外周血淋巴细胞分离液是一种用于分离人外周血淋巴细胞的生物试剂。淋巴细胞是人体免疫系统的重要组成部分，参与机体的免疫应答和免疫调节。人外周血淋巴细胞分离液通常由以下成分组成：

聚蔗糖：作为分离介质的主要成分，可以使红细胞沉降，从而使淋巴细胞与其他血细胞分离。

泛影葡胺：可以使淋巴细胞与其他血细胞分离，同时也可以防止淋巴细胞聚集。

磷酸盐缓冲液：用于调节溶液的pH值，保证分离过程的稳定性。

培养基：如RPMI-1640培养基等，用于提供淋巴细胞生长所需的营养物质。

使用人外周血淋巴细胞分离液时，首先需要采集人外周血样本，然后将其与分离液混合，通过离心等方法使淋巴细胞与其他血细胞分离。分离后的淋巴细胞可以用于进一步的实验研究，如免疫学检测、细胞培养等。

应用^[4][5]

人外周血淋巴细胞分离液可以用于组蛋白在脓毒症过程中对淋巴细胞的凋亡作用及机制

探讨组蛋白诱导淋巴细胞凋亡的机制；4.探讨组蛋白抗体能否减轻脓毒症引起的淋巴细胞凋亡。

研究方法1.检测脓毒症小鼠模型外周血中组蛋白H4的表达a)动物分组选取雄性C57小鼠18只(8-12周龄),随机分配至三大组：正常对照组,假手术组(sham组),脓毒症模型组(CLP组)。其中,正常对照组不做任何处理；sham组只打开腹腔,找到盲肠后再置入腹腔,关闭腹腔；脓毒症组采用盲肠结扎穿孔术(Cecal Ligation and Puncture,CLP)。于25℃室温下观察6小时,眼球取血约1mL,至肝素抗凝管,摇匀,分离血浆和淋巴细胞,采用western blot和流式细胞技术分别检测血浆中组蛋白H4和淋巴细胞凋亡率实验重复三次。b)脓毒症模型建立小鼠麻醉后固定,备皮,延腹中线切开皮肤,腹白线切开腹膜,腹腔内找到盲肠,于距盲肠末端1/3处结扎,使用21G针头穿孔,盲肠置回腹腔,关闭腹腔,缝合。将术后小鼠放入室温25℃的环境下观察、麻醉苏醒。c)外周血组蛋白H4检测0.7mL全血离心后留取血浆,稀释5倍,加Loading Buffer变性、离心,放于-20℃保存。BCA蛋白定量检测各组总蛋白浓度,确定各组总蛋白的上样量,检测各组组蛋白H4的表达量。d)动物淋巴细胞凋亡率检测应用密度梯度分离法和人外周血淋巴细胞分离液分离淋巴细胞,nnexinV-FITC/PI避光染色10min,流式细胞仪检测淋巴细胞凋亡率。

2. 组蛋白促进淋巴细胞凋亡及其作用强度a)细胞分组淋巴细胞来源于健康志愿者全血,经人外周血淋巴细胞分离液淋巴细胞细胞分离步骤,培养于1640培养液中。

(1) 组蛋白诱导淋巴细胞凋亡的浓度依赖性：淋巴细胞分为4大组,每组3管,每管2.5×105个细胞,分别与组蛋白Oug/mL(对照组)、50ug/mL、100ug/mL、200ug/mL于37℃培养箱中培养2h,等量1640培养基做对照。(2)组蛋白诱导淋巴细胞凋亡的时间依赖性：淋巴细胞分为3大组,每组3管,每管2.5×105个细胞,组蛋白100ug/mL,在37℃培养箱中培养0h(对照组)、2h、3h,等体积1640培养基做对照。b)人血淋巴细胞的提取抽取健康志愿者静脉血20mL,肝素抗凝,均分为5管,血液：PBS=1：1稀释血液,混匀后分别加入装有4m1人外周血淋巴细胞分离液的离心管上层,于25℃离心机1200g离心30min,吸取中间白膜层(富淋巴细胞),经PBS洗涤离心后,用1640培养基重悬所有淋巴细胞至同一EP管中,计数备用。

参考文献

[1]Functional roles for C5a receptors in sepsis.Rittirsch Daniel;Flierl Michael A;Nadeau Brian A;Day Danielle E;Huber-Lang Markus;Mackay Charles R;Zetoune Firas S;Gerard Norma P;Cianflone Katherine;Khl Jrg;Gerard Craig;Sarma J Vidya;Ward Peter A.Nature medicine.2008

[2]Sepsis:the dark side of histones.Catherine Chaput;Arturo Zychlinsky.Nature Medicine.2009

[3]Targeted Inhibition of p38 Mitogen-activated Protein Kinase Antagonizes Cardiac Injury and Cell Death Following Ischemia-Reperfusion in Vivo.Robert A.Kaiser;Orl;o F.Bueno;Daniel J.Lips;Pieter A.Doevendans;Fred Jones;Thomas F.Kimball;Jeffery D.Molkent.J.Biol.Chem.2004

[4]Histone H4 Is a Major Component of the Antimicrobial Action of Human Sebocytes.Dong-Youn Lee;Chun-Ming Huang;Teruaki Nakatsuji;Diane Thiboutot;Sun-Ah Kang;Marc Monestier;Richard L Gallo.Journal of Investigative Dermatology.2009

[5]蔡靓.组蛋白在脓毒症过程中对淋巴细胞的凋亡作用及机制[D].南方医科大学,2015.