三叉奥斯特线虫PCR试剂盒的应用

背景^[1-3]

三叉奥斯特线虫PCR试剂盒是一种用于快速灵敏检测三叉奥斯特线虫的试剂盒，基于PCR原理开发而成。该试剂盒具有以下特点：

高特异性：与其他病毒无交叉反应，无非特异性扩增。

高灵敏度：检测灵敏度可达10~100拷贝。

三叉奥斯特线虫PCR试剂盒操作简便：该系列所有试剂均采用相同的体系和条件，产品仅用于科研可同时进行多个检测。

高通量：多种双重PCR检测以及三重PCR检测试剂盒。

三叉奥斯特线虫PCR试剂盒使用时，用户只需提供DNA模板，将试剂盒与模板、引物和水混合后进行PCR反应，反应结束后取部分产物进行电泳检查即可观察到扩增结果。此外，还有探针法荧光定量PCR试剂盒可用于对PCR产物进行定量分析。

需要注意的是，使用PCR反应液时需在冰中配置，以保持其稳定性。同时，为了确保检测结果的准确性，建议在多次重复实验后取平均值作为最终结果。

三叉奥斯特线虫PCR试剂盒

三叉奥斯特线虫PCR试剂盒的操作步骤如下：

1.样本采集：从患者体内采集血液、粪便、组织等样本，并将其保存在无菌容器中。

2.DNA提取：将采集到的样本进行DNA提取，通常采用柱式或磁珠式DNA提取试剂盒。提取后的DNA应保存在-20°C或更低的温度下。

3.PCR反应体系准备：根据三叉奥斯特线虫PCR试剂盒说明书的要求，配制PCR反应体系，包括引物、荧光探针、dNTPs、DNA聚合酶等。

4.PCR反应：将提取的DNA加入到PCR反应体系中，进行PCR反应。反应条件和时间根据试剂盒说明书的要求进行设置。

5.结果分析：将PCR反应后的产物进行荧光信号检测，根据荧光信号的出现情况判断是否存在三叉奥斯特线虫的感染。

应用^[4][5]

三叉奥斯特线虫PCR试剂盒可以用于奥氏奥斯特线虫检测方法的建立与应用及其巨噬细胞转移抑制因子功能鉴定

针对奥氏奥斯特线虫巨噬细胞转移抑制因子同系物进行研究。通过比对分析得出，OoMIF与Teladorsagia circumcincta MIF(TciMIF)虽然没有相同的核苷酸序列，但其氨基酸的同源性达到了l00%，说明OoMIF和TciMIF是完全相同的蛋白。本研究通过原核表达系统分别表达OoMIF和OoMIF的突变体，该突变体将第二位的脯氨酸突变为甘氨酸。

三叉奥斯特线虫PCR试剂盒结果分析发现重组的OoMIF和OoMIF的突变体均不具备氧化还原酶活性，但OoMIF展现出很好的互变异构酶活性，其活性单位为105μmol/min/mg，ISO-1抑制试验证明，人类的MIF的抑制剂不能够完全抑制OoMIF的互变异构酶活性。OoMIF具有一定的抑制单核细胞移动作用但不是非常的明显，能够与人类MIF竞争与受体CD74结合且能后被巨噬细胞摄入胞内。L3和L4阶段线虫的OoMIF含量很高，且主要位于分泌蛋白和排泄物抗原中。本研究也证明OoMIF能够促进牛PBMC和U937细胞分泌IL-8and TNFа细胞因子。证明OoMIF在线虫感染牛的过程中，很可能在调节宿主的免疫系统起到一定的作用。

本研究为建立简单、便捷、快速的PCR检测方法对奥氏奥斯特线虫进行鉴别诊断，以GenBank公布的Ostertagia ostertagi间隔区ITS-2(登录号为AB245023.2)为靶基因，利用分子生物学软件Primer Primier5.0设计一对特异性PCR引物，通过三叉奥斯特线虫PCR试剂盒对PCR反应体系中的Mg2+浓度、dNTP添加量、引物浓度、Taq酶添加量及退火温度分别进行优化，以确定PCR的最佳反应条件，结果证明其适宜反应浓度为：3mM Mg2+，0.25mM dNTP，0.5μM引物浓度,0.5μL Taq酶(5U/μL)，其扩增最适退火温度为57°C。对PCR扩增产物测序结果证明其与GenBank公布的ITS-2序列的同源性达100%，从而证实三叉奥斯特线虫PCR试剂盒PCR扩增产物确为目的扩增产物。本研究同时建立了简单、便捷、快速的荧光定量PCR检测方法对奥氏奥斯特线虫进行鉴别诊断，以Ostertagia ostertagi ITS-2为靶基因,建立检测奥氏奥斯特线虫的荧光定量PCR检测方法。

通过分子生物学软件设计一对特异性荧光定量PCR引物,通过优化三叉奥斯特线虫PCR试剂盒反应条件，并对实时荧光定量PCR的特异性、敏感性、可靠性的检测。通过标准质粒的构建，生成标准曲线，曲线方程为：Y=－3.425x+39.79，曲线的相关系数R2=0.998，实验结果证明SYBR Green I荧光定量PCR能检测虫卵的最低浓度为1×103拷贝/μL,而普通PCR能检测的最低模板浓度为1×105拷贝/μL。表明该方法检测虫卵ITS-2的灵敏度是普通PCR的100倍。

参考文献

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[5]曲光刚.奥氏奥斯特线虫检测方法的建立与应用及其巨噬细胞转移抑制因子功能鉴定[D].吉林大学,2014.