NCI-H2110人非小细胞肺癌贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

NCI-H2110人非小细胞肺癌贴壁细胞系是一种来源于人非小细胞肺癌的贴壁细胞系，常用于研究肺癌的生物学特性、药物筛选和治疗策略。该细胞系具有以下特点：

来源：NCI-H2110细胞系来源于人非小细胞肺癌组织，经过多次传代和筛选，形成了一个相对稳定的细胞系。

形态特征：NCI-H2110细胞呈多边形或长条形，大小约为15-30微米，胞质丰富，核大而圆，核仁明显。

生长特性：NCI-H2110细胞生长迅速，传代周期约为24-48小时，可在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中稳定生长。

侵袭转移特性：NCI-H2110细胞具有较强的侵袭和转移能力，可通过Transwell小室实验等方法检测其侵袭和转移能力。

其他特性：NCI-H2110细胞还具有一定的增殖能力，可用作研究肺癌细胞增殖相关疾病的模型。

NCI-H2110人非小细胞肺癌贴壁细胞系

NCI-H2110人非小细胞肺癌贴壁细胞系培养操作

1)复苏NCI-H2110人非小细胞肺癌贴壁细胞系：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)NCI-H2110人非小细胞肺癌贴壁细胞系传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)NCI-H2110人非小细胞肺癌贴壁细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

NCI-H2110人非小细胞肺癌贴壁细胞系可以用于miR-539-5p通过抑制RRM2调控肺腺癌细胞恶性生物学行为及相关机制的研究

通过miRNA高通量测序技术和生物信息学方法筛选miR-539-5p为研究对象,并结合生物信息学分析和系列功能实验探讨miR-539-5p影响肺腺癌细胞恶性生物学行为的调控机制。

研究方法(1)构建肺腺癌Co-DEmiRNA-DEm RNA调控网络高通量测序技术完成临床队列(GSE151963)受试者血浆miRNA测序,下载公共平台癌基因组图谱(TCGA)肺腺癌数据集(TCGA＿LUAD)miRNAs和m RNAs测序数据;交集获得两个数据集(GSE151963和TCGA＿LUAD)表达一致的共同差异miRNAs(Co-DEmiRNAs)。miRDB、Target Scan和miRWalk在线数据库预测得到Co-DEmiRNAs靶基因m RNAs,TCGA＿LUAD肺腺癌组织差异m RNAs验证所预测靶基因m RNAs;Cytoscape软件构建Co-DEmiRNA-DEm RNA调控网络,确定核心miRNAs及靶基因。Cluster Profiler程序包完成核心miRNAs靶基因的基因功能注释和通路富集分析。

(2) miR-539-5p在肺腺癌血浆、组织、细胞中的表达Co-DEmiRNA-m RNA调控网络确定miR-539-5p为目标miRNA;GSE151963和TCGA＿LUAD数据确定miR-539-5p在肺腺癌血浆、组织中的表达水平,实时荧光定量PCR检测miR-539-5p在正常支气管上皮细胞(BEAS-2B)和3株肺腺癌细胞系(NCI-H2110人非小细胞肺癌贴壁细胞系、NCI-H1975、SPC-A1)表达量。

(3) miR-539-5p对肺腺癌细胞恶性生物学行为的影响通过miR-539-5p模拟物(mimic)、抑制物(inhibitor)及各自的阴性对照物(Negative Control,NC)分别转染人肺腺癌NCI-H2110人非小细胞肺癌贴壁细胞系细胞,构建过表达miR-539-5p和表达抑制的肺腺癌细胞模型,荧光实时定量PCR检测转染后细胞miR-539-5p表达量验证转染效率。通过CCK-8、平板克隆实验、划痕实验、Transwell小室法、流式细胞学技术检测细胞周期和凋亡、Western-Blot检测凋亡相关蛋白(Bcl-2和Bax)表达评价miR-539-5p表达量对肺腺癌细胞恶性生物学行为的影响。

(4)筛选miR-539-5p的直接靶基因及验证分析Gene Expression Omnibus(GEO)数据库四组肺腺癌数据集(GSE10072、GSE19188、GSE7670和GSE31210)、获得共同差异基因(Common differentially expressed genes,Co-DEGs),并与Co-DEmiRNA-DEm RNA调控网络中miR-539-5p靶基因交集、筛选miR-539-5p核心靶基因;GEPIA数据库探讨肺腺癌miR-539-5p核心靶基因的临床价值及并确定直接靶基因,Kaplan Meier plotter和cbioportal等数据库评价直接靶基因及其突变状态在肺腺癌中的临床价值。前述结果确定重组人核糖核苷酸还原酶M2(RRM2)为miR-539-5p直接靶基因。实时荧光定量PCR检测RRM2在正常支气管上皮细胞(BEAS-2B)和3株肺腺癌细胞系(NCI-H2110人非小细胞肺癌贴壁细胞系、NCI-H1975、SPC-A1)表达情况。RT-PCR和Western-Blot分别检测转染miR-539-5p模拟物、抑制物及各自的阴性对照物调控人肺腺癌NCI-H2110人非小细胞肺癌贴壁细胞系细胞RRM2 m RNA和蛋白表达。采用RRM2 3′UTR点突变的方法构建含有萤光素酶报告基因的RRM23′UTR Mut(突变型)质粒载体和含有萤光素酶报告基因的RRM2 3′UTR WT(野生型)质粒载体;两者与miR-539-5p mimic和mimic-NC共转染NCI-H2110人非小细胞肺癌贴壁细胞系细胞,萤光素酶报告基因系统检测NCI-H2110人非小细胞肺癌贴壁细胞系细胞萤光素酶表达量。

参考文献

[1]Secreted phosphoprotein 1 as a potential prognostic and immunotherapy biomarker in multiple human cancers.[J].Zeng Ping;Zhang Xujun;Xiang Tianxin;Ling Zongxin;Lin Chenhong;Diao Hongyan.Bioengineered,2022

[2]Lung cancer is also a hereditary disease.[J].Benusiglio Patrick R;Fallet Vincent;SanchisBorja Mateo;Coulet Florence;Cadranel Jacques.European respiratory review:an official journal of the European Respiratory Society,2021

[3]The Intricate Interplay between Cell Cycle Regulators and Autophagy in Cancer[J].Ziegler Dorian V.;Huber Katharina;Fajas Lluis.Cancers,2021

[4]p53 signaling in cancer progression and therapy.[J].Marei Hany E;Althani Asmaa;Afifi Nahla;Hasan Anwarul;Caceci Thomas;Pozzoli Giacomo;Morrione Andrea;Giordano Antonio;Cenciarelli Carlo.Cancer cell international,2021

[5]王小军.miR-539-5p通过抑制RRM2调控肺腺癌细胞恶性生物学行为及相关机制的研究[D].兰州大学,2023.