人胰腺导管癌细胞的应用

背景^[1-3]

人胰腺导管癌细胞是一种来源于人胰腺导管癌的细胞系，常用于研究胰腺癌的生物学特性、药物筛选和治疗策略。该细胞系具有以下特点：

来源：人胰腺导管癌细胞系来源于人胰腺导管癌组织，经过多次传代和筛选，形成了一个相对稳定的细胞系。

形态特征：人胰腺导管癌细胞呈多边形或长条形，大小约为15-30微米，胞质丰富，核大而圆，核仁明显。

生长特性：人胰腺导管癌细胞生长迅速，传代周期约为24-48小时，可在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中稳定生长。

侵袭转移特性：人胰腺导管癌细胞具有较强的侵袭和转移能力，可通过Transwell小室实验等方法检测其侵袭和转移能力。

其他特性：人胰腺导管癌细胞还具有一定的增殖能力，可用作研究胰腺癌细胞增殖相关疾病的模型。

人胰腺导管癌细胞

人胰腺导管癌细胞培养操作

1)复苏人胰腺导管癌细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)人胰腺导管癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)人胰腺导管癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

人胰腺导管癌细胞可以用于miR-193a-3p在胰腺导管腺癌中通过靶向CCND1抑制癌细胞增殖的研究

探讨miR-193a-3p在胰腺导管腺癌组织及细胞中的表达水平,及其对胰腺导管腺癌细胞在增殖和侵袭方面的作用和影响;并利用预测软件发现miR-193a-3p与靶基因CCND1拥有碱基结合序列。通过实验研究miR-193a-3p与靶基因CCND1两者的相关性,为下一步胰腺癌的相关机制的研究,以及寻找更好的诊断和治疗方法提供理论及实验基础。

材料和方法1、收集胰腺导管腺癌蜡块组织37例、正常胰腺胰腺蜡块组织42例,通过qRT-PCR检测miR-193a-3p及CCND1的表达水平,并通过受试者工作特征(ROC)曲线分析其与胰腺癌的病理诊断联系。从GEO和Arrayexpress数据库上查找并下载检测PDAC组织中miR-193a-3p和CCND1的表达芯片,从芯片中提取胰腺导管腺癌组织与正常胰腺组织中miR-193a-3p、CCND1的表达数据,结合从临床收集的胰腺导管腺癌组织中检测到的miR-193a-3p、CCND1的表达水平数据进行META分析,从更大的样本量上探讨miR-193a-3p和CCND1在胰腺导管腺癌中的表达水平的联系。

2、通过qRT-PCR检测实验,对比人胰腺导管癌细胞系BxPC-3、PANC-1、AsPC与胰腺正常细胞系Hped6-C7中miR-193a-3p和CCND1的基因表达水平。

3、应用慢病毒感染过表达miR-193a-3p的方法,在人胰腺导管癌细胞BxPC-3及PANC-1细胞中过表达miR-193a-3p后,通过CCK8细胞增殖、细胞周期及凋亡、transwell细胞迁移及小室侵袭等实验,研究miR-193a-3p对胰腺导管腺癌细胞增殖、凋亡及侵袭的影响。

4、运用miRwalk靶基因预测网站(包含12个预测网站)预测miR-193a-3p的靶基因,并在DAVID上进行GO(Gene Ontology)分析及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析,在String上进行靶基因的蛋白互作网络分析。

5、根据检测的胰腺癌组织中miR-193a-3p和CCND1的表达数据,分析miR-193a-3p与CCND1的表达相关性的大小,使用生物信心学靶标预测软件寻找miR-193a-3p和CCND1之间是否存在基因互补序列。

6、通过过表达miR-193a-3p,检测CCND1的表达水平,然后对比阴性对照组,明确两者是否有明显差异,miR-193a-3p与CCND1的直接靶向结合关系通过应用双荧光素酶基因报告实验验证。

结果1、在37例PDAC和42例正常胰腺组织中,通过PCR实验进行对比,本研究发现miR-193a-3p在PDAC组织中的表达明显低于正常的胰腺组织,ROC曲线下面积(AUC=0.662,p=0.013)提示miR-193a-3p的低表达与人胰腺导管癌细胞具有一定的相关性。通过检索GEO和Arrayexpress数据库,获取3张检测PDAC与正常胰腺组织中miR-193a-3p表达的基因芯片,通过分析3张芯片数据,研究发现miR-193a-3p的表达在PDAC低于正常胰腺组织。结合本课题组检测的表达数据进行meta分析,结果提示miR-193a-3p在PDAC组织中的表达量显著低于正常胰腺组织(SMD=-0.57,CI=-0.84--0.31,p<0.001)并具有诊断意义(SROC AUC=0.74)。

在人胰腺导管癌细胞PANC-1、BxPC-3、AsPC-1及正常胰腺导管上皮细胞系Hped6-C7中,应用荧光定量PCR的方法检测miR-193a-3p的表达水平情况,结果显示miR-193a-3p在三株胰腺腺癌细胞中的表达均明显低于正常胰腺细胞(P<0.05)。在BxPC-3及PANC-1细胞中用病毒感染过表达miR-193a-3p后,细胞的增殖受到了明显的抑制、细胞凋亡的趋势有明显的加速,以及细胞周期被阻滞在G1及G2/M期。

参考文献

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[2]LncRNA BC032020 suppresses the survival of human pancreatic ductal adenocarcinomacells by targeting ZNF451[J].Zhipeng Zhang;;Hongxi Chen;;Yebin Lu;;Tiecheng Feng;;Weijia Sun.International Journal of Oncology,2018(4)

[3]Clinical and biological significance of miR-193a-3p targeted KRAS in colorectal cancer pathogenesis[J].Afraa Mamoori;;Riajul Wahab;;Farhadul Islam;;Katherine Lee;;Jelena Vider;;Cu-Tai Lu;;Vinod Gopalan;;Alfred King-yin Lam.Human Pathology,2018

[4]MicroRNA?720 inhibits pancreatic cancer cell proliferation and invasionby directly targeting cyclin D1[J].Yu Zhang;;Yueying Su;;Yabing Zhao;;Guoqiang Lv;;Ying Luo.Molecular Medicine Reports,2017(6)

[5]陈智敏.miR-193a-3p在胰腺导管腺癌中通过靶向CCND1抑制癌细胞增殖的研究[D].广西医科大学,2019.