LX-2 人肝星形细胞的应用

背景^[1-3]

LX-2人肝星形细胞是一种常用的细胞系，用于研究肝星形细胞的生物学特性和肝纤维化等方面的机制。这种细胞系是通过将SV40大T抗原转染永生化原代人肝星状细胞，然后在低血清培养基条件下选择性培养早期传代细胞而产生的。

LX-2人肝星形细胞具有上皮细胞样的形态，贴壁生长，可以用于体外实验来模拟肝纤维化的过程或研究肝星形细胞的生物学特性。此外，这种细胞系还可以用于药物筛选和毒性测试等方面。

LX-2人肝星形细胞系是一种永生化的细胞系，可以连续传代，但在传代过程中需要注意避免污染和交叉污染。同时，为了保持细胞的稳定性和生物学特性，需要使用适当的培养基和培养条件进行培养。

LX-2人肝星形细胞是一种重要的细胞系，在肝纤维化和药物筛选等领域有着广泛的应用。

LX-2人肝星形细胞

LX-2人肝星形细胞系培养操作

1)复苏LX-2人肝星形细胞系：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)LX-2人肝星形细胞系传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)LX-2人肝星形细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

LX-2人肝星形细胞系可以用于RHL抑制大鼠肝纤维化及LX-2人肝星形细胞系增殖的机制

通过体内动物实验探讨赖氨大黄酸(RHL)抗大鼠胆汁淤积性肝纤维化的具体分子机制。于此同时,体外培养人肝星形细胞(HSC)中的LX-2人肝星形细胞系株,探讨RHL抑制HSC活化、增殖的具体作用机制。为RHL治疗胆汁淤积性肝纤维化提供实验依据。

方法1)体内动物实验:(1)将30只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、赖氨酸组、35 mg·kg-1及70 mg·kg-1RHL组,每组6只,胆总管结扎(BDL)手术制备胆汁淤积性肝纤维化动物模型。

(2) 进行HE染色,镜下观察各组大鼠肝脏组织病理学改变;Masson染色观察各组大鼠肝脏组织纤维化程度。

(3) 应用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测各组大鼠肝脏组织中Smad2、Smad3 m RNA的相对表达量。

(4) 采用Western blotting方法,检测各组大鼠肝脏组织中Smad2、Smad3的蛋白相对表达量。

2) 体外细胞实验:(1)体外培养HSC中的LX-2人肝星形细胞系株,分成四个实验组,分别为对照组、RHL三个剂量组(50、100和150μmol·l-1)。

(2) 用流式细胞术方法检测各实验组LX-2人肝星形细胞系的细胞凋亡及细胞周期情况。

(3) 免疫组织化学检测Smad2和Smad3在各实验组LX-2人肝星形细胞系中的表达情况。

(4) 应用q RT-PCR检测各实验中Smad2、Smad3 m RNA的相对表达。

(5) 采用Western blotting方法,检测各实验组LX-2人肝星形细胞系中Smad2、Smad3蛋白相对表达量。

结果1)体内动物实验:(1)病理学检查结果可见,与假手术组比较,模型组大鼠肝脏组织中肝小叶结构大量被破坏,汇管区显著增生并伴纤维大量增生;与模型组比较,RHL组大鼠肝脏组织中的肝脏小叶结构较为完整,结构损伤轻微,胆管周围轻度增生,纤维堆积较少且不明显。动物模型建立成功。

(2) q RT-PCR和Western blotting结果显示,与假手术组比较,模型组大鼠肝脏组织中Smad2、Smad3 m RNA和蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,RHL组大鼠肝脏组织中Smad2、Smad3 m RNA和蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。

3) 体外细胞实验:(1)流式细胞术检测结果显示,与对照组比较,RHL组LX-2人肝星形细胞系GO/1期细胞比例明显升高,S期细胞比例明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。

(3) 免疫组织化学染色结果显示Smad2和Smad3在LX-2人肝星形细胞系胞浆中表达,与对照组相比,RHL组细胞的表达量明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。

(4) q RT-PCR和Western blotting结果显示,与对照组比较,RHL组处理过得LX-2人肝星形细胞系中Smad2、Smad3 m RNA和蛋白表达水平下降,差异有统计学意义(P<0.05)。

结论1)RHL可能是通过抑制TGF-β1/Smads信号通路的传导,达到抗纤维化的作用。2)RHL可能是通过促进LX-2人肝星形细胞系的凋亡,达到抑制LX-2人肝星形细胞系增殖的作用。3)RHL可能是通过抑制TGF-β1/Smads信号通路转导,达到抑制HSC细胞活化的作用。

参考文献

[1]Transforming growth factor beta signaling in hepatocytes participates in steatohepatitis through regulation of cell death and lipid metabolism in mice[J].Ling Yang;;Yoon Seok Roh;;Jingyi Song;;Bi Zhang;;Cheng Liu;;Rohit Loomba;;Ekihiro Seki.Hepatology,2014(2)

[2]Study of the cellular mechanism of Sunitinib mediated inactivation of activated hepatic stellate cells and its implications in angiogenesis[J].Syamantak Majumder;;Anne-Christine Piguet;;Jean-François Dufour;;Suvro Chatterjee.European Journal of Pharmacology,2013

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[4]Attenuation of early liver fibrosis by pharmacological inhibition of smoothened receptor signaling[J].Akshay Pratap;;Saurabh Singh;;Vaibhav Mundra;;Ningning Yang;;Ravikiran Panakanti;;James D.Eason;;Ram I.Mahato.Journal of Drug Targeting,2012(9)

[5]王琳.RHL抑制大鼠肝纤维化及LX-2细胞增殖的机制[D].华北理工大学,2017.