大鼠椎间盘髓核细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠椎间盘髓核细胞是从大鼠的椎间盘组织中分离出来的一种细胞，属于原代细胞。这种细胞在培养瓶中可以贴壁或悬浮生长，通常用于研究脊柱退行性疾病、药物筛选、基因治疗等方面。

大鼠椎间盘髓核细胞的分离和培养方法通常包括组织块法、酶消化法等。其中，组织块法是将椎间盘组织切成小块，然后种植在培养瓶中，让细胞从组织块中生长出来。酶消化法则是使用酶将椎间盘组织分解成单个细胞，然后进行培养。

大鼠椎间盘髓核细胞在培养过程中需要使用特定的培养基和生长因子，以保证细胞的生长和繁殖。同时，还需要注意细胞的交叉污染和支原体感染等问题。

大鼠椎间盘髓核细胞

大鼠椎间盘髓核细胞培养操作

1)复苏大鼠椎间盘髓核细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)大鼠椎间盘髓核细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)大鼠椎间盘髓核细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

大鼠椎间盘髓核细胞可以用于线粒体凋亡通路在氧化应激诱导大鼠髓核细胞凋亡中的作用研究

体外构建大鼠椎间盘髓核细胞氧化应激模型,探讨线粒体凋亡通路在氧化应激诱导椎间盘髓核细胞凋亡中的作用及意义,为进一步预防和治疗椎间盘退变性疾病奠定实验和理论基础。研究方法：1、实验用SPF级雄性SD大鼠由南方医科大学动物实验中心提供,无菌条件下取出大鼠腰椎节段,解剖显微镜下尖刀切开椎间盘纤维环,用眼科镊夹取胶冻样髓核组织。采用胰酶/胶原酶消化法原代培养大鼠椎间盘髓核细胞,运用免疫组化染色,免疫荧光检测对椎间盘髓核细胞进行鉴定。

2、以不同浓度过氧化氢(H202)作用于椎间盘髓核细胞制造氧化应激模型；将生长良好的第3代椎间盘髓核细胞制成细胞悬液,按5000个/孔接种于96孔培养板中。待细胞贴壁后,融合达80%-90%时,换无血清DMEM-F12培养液继续培养24h,使细胞处于静止期。对照组不给予H2O2处理,实验组用50,100,200,400μmol/LH202处理6h。CCK8法检测各组细胞的存活率。

3、细胞凋亡率检测：对照组不给予H202处理,实验组取两个浓度组(100μmol/L,200μmol/L H202处理6h。Hoechst33258染色以及Annexin V/PI流式细胞术检测各组细胞凋亡率。

4、DCFH-DA荧光探针检测各组细胞内ROS含量、JC-1染色检测各组细胞线粒体膜电位的变化。

5、免疫印迹(Western blot)法检测凋亡相关蛋白(细胞色素C,Bax,Bcl-2,caspase-3)的变化。

6、所有统计分析均通过SPSS13.0统计软件完成。数据均用均值±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用最小显著差异法(least significant difference,LSD)方法检验,P<0.05认为差异有统计学意义。

研究结果：1、原代培育的细胞呈类呈多角形、纺锤形或梭形,达亚融合状态后呈漩涡状或火焰状的细胞团,胞质丰富,具有折光性,有一个较大的卵圆形核,轮廓清晰。Ⅱ型胶原免疫组化、免疫荧光染色均可见阳性表达,因此可鉴定此细胞为椎间盘髓核细胞。

2、CCK8法检测结果显示H2O2对椎间盘髓核细胞的生长具有明显的抑制作用,随着浓度的升高,细胞生存率降低,呈浓度依赖关系,各浓度组细胞生存率与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术检测各组细胞凋亡结果显示,随着H202浓度升高细胞凋亡比例增加,100μmol/L H2O2细胞凋亡率为(22.43±2.66)%,200μmol/L H2O2细胞凋亡率为(32.5±2.22)%,均较对照组明(5.3±1.87)%明显升高,差异均有统计学意义(P<0.01)。

3、与对照组相比,实验组大鼠椎间盘髓核细胞受H202诱导后细胞内活性氧水平增加,线粒体跨膜电位下降,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)4、Western blot检测显示实验组细胞经H202诱导后Bcl-2蛋白表达降低,而胞浆细胞色素C、Bax、活化型caspase-3升高,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。

参考文献

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[2]α-Mangostin protects lipopolysaccharide-stimulated nucleus pulposus cells against NLRP3 inflammasome-mediated apoptosis via the NF-κB pathway.[J].Chen Jingyang;Bian Meiru;Pan Lingxiao;Yang Hanshi.Journal of applied toxicology:JAT,2022

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