大鼠小肠黏膜上皮细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠小肠黏膜上皮细胞是覆盖在小肠黏膜表面的重要细胞，是消化道的第一道防线，具有多种重要生理功能，如吸收、分泌和转运等。同时，它们在黏膜免疫反应中发挥关键作用，能够决定黏膜免疫反应的发生、性质和强度。

这些细胞在科学研究中有广泛的应用，如生长抑素对肠上皮细胞屏障功能的保护作用及机制研究等。此外，这些细胞也可用于药物筛选、基因治疗等方面的研究。

大鼠小肠黏膜上皮细胞的分离和培养需要经过特定的操作流程，以保证细胞的纯度和质量。一般来说，这些细胞在标准操作流程下，经过机械分离法和胶原酶消化法处理后，再通过上皮细胞专用培养基进行培养和筛选。

大鼠小肠黏膜上皮细胞

大鼠小肠黏膜上皮细胞培养操作

1)复苏大鼠小肠黏膜上皮细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)大鼠小肠黏膜上皮细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)大鼠小肠黏膜上皮细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

大鼠小肠黏膜上皮细胞可以用于附子理中丸对脾阳虚大鼠海马、下丘脑和小肠cAMP-PKA通路的影响研究

1.电镜检测大鼠小肠黏膜上皮细胞、海马及下丘脑组织神经元线粒体超微结构的变化。

2.ELISA法检测小肠、海马、下丘脑组织中β-EP、cAMP和PKA含量变化。10.放射免疫法检测小肠组织中ATP含量的变化。

3.免疫组化SP法检测小肠、海马、下丘脑组织中β-内啡肽μ受体的表达变化。

4.RT-PCR法检测大鼠小肠黏膜上皮细胞中CREB、Sirt1和线粒体UCP2蛋白mRNA的表达变化。

5.Western blotting法检测大鼠小肠黏膜上皮细胞中CREB、Sirt1和线粒体UCP2蛋白的表达变化。

6.化学荧光法检测海马和下丘脑组织中ROS含量变化。

7.统计分析:所有数据均采用(?)±S表示,应用SPSS19.0统计软件进行数据分析。组间差异性检验采用单因素方差分析法或秩和检验法进行统计分析。

结果:1.与空白组比较,模型组大鼠体质量、进食量、肛温明显下降(P均<0.01),粪便含水率明显升高(P<0.01),直立次数、运动距离、运动时间、平均运动速度和双前肢拉力明显低于空白组(P均<0.01);与模型组比较,中药组大鼠体质量和进食量呈现明显上升(P均<0.01),粪便含水率降低(P<0.01),直立次数、运动距离、平均运动速度和双前肢拉力明显高于模型组(P均<0.01),脾阳虚证类人宏观表征明显改善;恢复组大鼠上述指标变化与模型组比较无统计学差异。

2.与空白组比较,模型组大鼠大鼠小肠黏膜上皮细胞、海马和下丘脑神经元细胞线粒体超微结构明显损伤,线粒体减少、肿胀,线粒体嵴肿胀断裂,空泡化;与模型组比较,中药组大鼠大鼠小肠黏膜上皮细胞、海马和下丘脑神经元细胞线粒体超微结构损伤程度减轻,线粒体形态结构相对完整,线粒体嵴排列规则,肿胀、断裂和空泡化减少;恢复组大鼠上述组织细胞线粒体超微结构变化与模型组相同。

3.与空白组比较,模型组和恢复组大鼠小肠组织中ATP含量显著降低(P均<0.01);与模型组比较,中药组大鼠小肠组织中ATP含量升高(P<0.01);与中药组比较,恢复组大鼠小肠组织中ATP含量显著降低(P<0.01)。

4.与空白组比较,模型组大鼠小肠、海马和下丘脑组织中β-EP含量和μ受体表达明显升高(P均<0.01);与模型组比较,中药组大鼠小肠、海马和下丘脑组织中β-EP含量和μ受体表达降低(P<0.05或P<0.01);恢复组大鼠小肠、海马和下丘脑组织中β-EP含量和μ受体表达与模型组比较无统计学差异。

5.与空白组比较,模型组大鼠小肠、海马和下丘脑组织中cAMP和PKA含量明显降低(P均<0.01);与模型组比较,中药组大鼠小肠、海马和下丘脑组织中cAMP和PKA含量明显升高(P<0.05或P<0.01);恢复组大鼠小肠、海马和下丘脑组织中cAMP和PKA含量低于中药组(P<0.05或P<0.01)。

参考文献

[1]The neuroprotective effect of human uncoupling protein 2(hUCP2)requires cAMP-dependent protein kinase in a toxin model of Parkinson's disease[J].Ran-Der Hwang;;Lyle Wiemerslage;;Christopher J.LaBreck;;Munzareen Khan;;Kavitha Kannan;;Xinglong Wang;;Xiongwei Zhu;;Daewoo Lee;;Yih-Woei C.Fridell.Neurobiology of Disease,2014

[2]Obesity and Appetite Control[J].Keisuke Suzuki;;Channa N.Jayasena;;Stephen R.Bloom;;Bernard Thorens.Experimental Diabetes Research,2012

[3]Inhibition of motility in isolated horse small intestine is mediated byκbut notμopioid receptors[J].A.MENOZZI;C.POZZOLI;C.ZULLIAN;E.POLI;P.SERVENTI;S.BERTINI.Equine Veterinary Journal,2012(3)

[4]Nucleotide variations in mitochondrial DNA and supra-physiological ROS levels in cytogenetically normal cases of premature ovarian insufficiency[J].Manoj Kumar;;Dhananjay Pathak;;Alka Kriplani;;A.C.Ammini;;Pankaj Talwar;;Rima Dada.Archives of Gynecology and Obstetrics,2010(6)

[5]孙大宇.附子理中丸对脾阳虚大鼠海马、下丘脑和小肠cAMP-PKA通路的影响研究[D].辽宁中医药大学,2019.