抗体偶联药物服务（ADCs）的制备

背景及概述^[1]

抗体偶联药物服务（ADCs）包括从单克隆抗体研发，到细胞毒素合成、连接子设计制备到ADCs合成、纯化工艺研发、分析方法研究、质量标准建立的一站式解决方案，在保证药物安全的前提下，成都的提高药物的杀伤能力。利用抗体实现细胞毒性药物靶向递送的理念可追溯至上世纪初。随着基因工程技术、抗体制备技术的成熟，以及新型化学连接技术的出现，近年来这一领域取得了里程碑式的发展，并实现了药物的临床转化。早在2000年Gemtuzumabozogamicin(商品名Mylotarg)就已成为首个获得FDA批准的抗体偶联药物，用于治疗急性髓系白血病(AML)，然而其III期临床试验发现其具有肝毒性，并且与对照组相比疗效并不显著，Pfizer于2010年6月申请退市。

2011年8月，ADC药物Brentuximabvedotin(商品名Adcetris)通过FDA批准，同时它也是近30年来首个FDA新批准的用于治疗霍奇金淋巴瘤的药物和首个用于治疗罕见疾病系统性间变性大细胞淋巴瘤的药物。2013年2月，另一个抗体偶联药物Ado-trastuzumabemtansine(商品名Kadcyla)获FDA批准用于治疗HEＲ2阳性转移性乳腺癌。这两个ADC药物的上市仅仅只是抗体偶联药物研究热潮的缩影，目前，有约80个ADC药物处于研发阶段，截止2013年11月，已有35个进入临床试验阶段。与传统的抗体药物或者细胞毒性药物相比，抗体偶联药物具有更为复杂的结构和质量属性。抗体偶联药物由两个部分即抗体和药物通过接头分子连接而成。开发安全性高、疗效好的ADC药物有赖于抗体、药物的选择，以及接头技术的优化三个方面的共同发展。同时，其复杂的质量属性对抗体偶联药物的质量控制也提出了更高的要求。

制备^[1]

抗体偶联药物服务（ADCs）中抗体偶联药物的制备如下：

抗体偶联药物服务（ADCs）中抗体偶联药物的制备方法涉及抗体氨基酸残基的随机修饰和将药物分子选择性地引入到抗体分子上。其中的随机修饰过程包括对羧酸进行氨基化，赖氨酸侧链的氨基进行酰基化等。抗体分子含有很多可用来修饰交联的基团，交联基团有氨基和羧基。药物分子选择性地结合抗体的方法包括基因重组技术表达融合蛋白、抗体氧化多糖的还原氨基化、抗体链间二硫键的还原烷基化。

1）抗体还原

采用抗体上的二硫键进行药物偶联生成抗体药物偶联物，首先需要将抗体的二硫键进行还原产生巯基。常选用的抗体类型是IgG即免疫球蛋白。IgG型抗体的分子量大约为150KD，毛细管内皮层和细胞外间隙难以透过如其巨大的抗体及其偶联分子，因此到达肿瘤细胞的抗体占实际给药量比值较小，对于IgG类抗体通常小于0.1%的注射量会到达肿瘤部位。根据重链恒定区的不同，抗体分子主要有五种类型，分别记为IgG，IgM，Ig，IgE和IgD。其中IgG，IgE和IgD3种类型的抗体分子都包括有两条重链和两条轻链组成的Ig单体。通过X射线衍射分析，抗体分子主要由三个部分组成，两个相同的抗体片段-抗原结合臂和一个容易结晶的片段。

2）抗体的还原检测

通过控制还原剂的用量可以产生一定数量的巯基，如果已给定所需药物的偶联数量，需要设计实验，控制还原剂反应比例，反应温度，反应时间，优化还原反应参数，以达到所需要的产物。研究表明，每个抗体分子上连接4个药物时，并且药物偶联到铰链区时药效最显著且体内存活率最高。因此需要通过化学方法控制抗体还原反应，使抗体还原铰链区的二硫键发生还原，产生四个巯基来偶联带有接头的药物。游离的还原剂分散在溶液中，只要还原剂的量足够，不仅能够将暴露在蛋白质外面的二硫键还原，加大还原剂用量后还能将包裹在蛋白质内部的二硫键进行还原，还原蛋白质二硫键的还原剂包括硫醇类还原剂和膦类还原剂包括三正丁基膦和三羧乙基膦。固定化的还原剂，顾名思义，就是将常用的二硫键还原剂固定在一些介质上，通常是固定到琼脂糖上。使用固定化的还原试剂进行二硫键的还原，可以提高还原剂的使用效率，适用范围更广。同时，由于还原剂是固定到介质上，因此还原反应完成后，不需要再进行还原剂除去的步骤，减少了蛋白质的损失。报道有很多方法可以用来检测抗体以及抗体片段，这些都可以用来作为抗体还原程度检测的借鉴方法，包括十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，毛细管电泳，分子排阻色谱分子排阻色谱-质谱联用等。

3）抗体与药物偶联抗

体被还原到合适的程度，可以进行与药物的偶联反应。其偶联方式有多种，可以通过牢固的共价键结合，也可以通过疏散的离子键和疏水键结合，对ADC药物来说，首先要保证在水溶液中的稳定性，方便使用。其次连接物不仅要在血液循环中保持稳定以减少药物的毒副作用，而且进入靶细胞以后要迅速释放药物发挥活性。现今，连接抗体和毒性药物的连接物包括可断开的连接物和不可断开的连接物。根据不同的靶细胞通过体内外的实验筛选出适合每种药物的连接方式。通常来说，抗体-刺孢霉素偶联物采用对酸敏感的腙连接，抗体-美登醇偶联物采用二硫键或者硫醚连接，抗体-auristatin偶联物的连接是能在溶酶体里被酶切的肽连接或者是不可断开的硫醚连接。

4）纯化方法

抗体药物偶联反应终止后，需要除去多余的药物接头以及有机溶剂，EDTA等添加物。根据反应规模的大小，有许多方法可以选择。实验室规模如微克级或者更少，可以采用离子交换等色谱，亲和层析，凝胶过滤方法，离心超滤法以及离子交换层析和亲和层析等。规模到几百毫克或者更多的，可以采用超滤/透析联合。离子交换层析包括阳离子交换层析和阴离子交换层析。不同分子量的蛋白质所带有的电荷量是不同的，因此它们与交换剂的结合能力有强有弱，随着流动相的流动会被依次洗脱下来，从而实现不同蛋白之间的分离。亲和层析通常只用一步处理，就可以将目标蛋白质与大量的杂质分离，能够完成一般方法很难完成的分离，并且可以达到大于90%的纯度。

研发现状

2000年，首个抗体偶联药物(商品名Mylotarg，Pfizer研发)被FDA批准用于治疗急性粒细胞白血病，但由于偶联技术、靶向性、有效性等受限，完整的抗体偶联药物在血液不稳定，导致致死性毒性的产生，于2010年撤市。随着Takeda/Seattle Genetics通过对原有技术的改进，利用自己的抗体偶联技术开发新型ADC(商品名Adcetris)，并与2011年被FDA批准用于治疗霍奇金淋巴瘤和系统性间变性大细胞淋巴瘤。2013年抗体偶联药物再次取得突破，基因泰克/ImmunoGen联合开发的(商品名Kadcyla)被FDA批准用于HEＲ2阳性乳腺癌，这是首个针对实体瘤的抗体偶联药物。随着这两个药物的研发成功，ADC药物再次以火热的状态进入人们的研究视野。以下为目前在临床的一些药物。

1）SC16LD6.5：该药由StemCentrx公司研制，由一种名为SC16的抗体和一种名为D6.5的DNA损伤制剂组成。SC16靶向的蛋白能在大部分非小细胞肺癌的肿瘤细胞表面表达，而D6.6是一种药效很强的化疗药物，强烈损伤DNA结构。目前，该药正在美国进行Ⅱ期临床试验，招募非小细胞肺癌的患者。

2）Ｒesimmune：该药又名A-dmDT390-bisFv，最初由美国国立卫生研究院(NIH)的两位博士研制，后授权给Angimmune公司，用于治疗淋巴瘤或T细胞驱动的免疫系统疾病。该药的特殊之处在于，它是一个抗体-类毒素偶联物，即把白喉类毒素黏附到一个抗体上，靶向CD3e阳性的恶性T细胞。目前，该药在美国已进行到Ⅱ期临床试验阶段，适应证为皮肤T细胞淋巴瘤和第4期黑色素瘤。

3）Polatuzumabvedotin和Pinatuzumabvedotin：这两个药的原研厂家均是基因泰克。Polatuzumabvedotin由一种把向CD79b的单克隆抗体链接一种小分子细胞毒性的微管抑制剂组成；Pinatuzumabvedotin则由一种靶向CD22的单克隆抗体链接MMAE组成。目前，这两种药物均在进行Ⅱ期临床试验，准在评价这两种药物分别与利妥昔单抗合用治疗难治复发性滤泡型非霍奇金淋巴瘤或难治复发性弥漫型B大细胞淋巴瘤的安全有效性。

4）Labetuzumab-SN-38：该药是Immunomedics研制的由人源化单克隆抗体Labetuzumab和伊立替康活性代谢物SN-38组成的抗体偶联药物，用于治疗肺癌、乳腺癌和结肠癌。其能选择性地把SN-38传递到肿瘤组织，使对其他组织的毒性最小化。目前，该药正在进行转移性结肠癌的Ⅱ期临床试验。

5）Moxetumomabpasudotox(CAT-8015)：该药由Genencor公司原研，2005年被剑桥抗体技术公司(CAT，属于阿斯利康公司)购买，同时购买的还有该药的代产品CAT-3888。CAT-8015为CD22单克隆抗体与假单孢菌外毒素的偶联物，体外研究显示，其对儿童B-ALL样本具有治疗活性。目前已在芜响应或复发性多毛细胞白血病患者中开展Ⅲ期临床试验。

6）伊珠单抗-奥佐米星(Inotuzumabozogamicin)：该药由辉瑞公司原研，是由靶向于CD22的一种单克隆抗体和一种细胞毒性制剂奥佐米星组成。CD22是一种细胞表面抗原，表达于约90%的B细胞恶性肿瘤上。当Inotuzumabozogamicin结合至恶性B细胞表面的CD22抗原后，被内化进入细胞，奥佐米星被释放出来进而摧毁细胞。2013年，辉瑞宣布终止其治疗复发性或难治性CD22+侵袭性非霍奇金淋巴瘤的Ⅲ期临床研究，然而，仍将继续在成人急性淋巴细胞白血病中开展Ⅲ期临床试验。

主要参考资料

[1] 抗体偶联药物的研究进展与质量控制

[2] 抗体偶联药物研究进展