抗人SUMO3抗体的制备方法

背景及概述^[1]

SUMO蛋白分布广泛。人类基因组主要编码4种SUMO蛋白亚型SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO4。其中，SUMO1～3起主要作用并在各种组织中均有表达，而SUMO4主要在肾、脾和淋巴结中表达。在各亚型中，SUMO1和SUMO2具有50％的序列同源性，SUMO2和SUMO3高度相似，仅有3个氨基酸差异，同源性高达95％，所以经常共写为SUMO2／3。在针对3种SUMO蛋白亚型的实验组中，发现抗SUMO2抗体和抗SUMO3抗体在PBC和其他自身免疫性疾病两组间的阳性率差异P值接近，表明SUMO2和SUMO3二者同源性高。鉴于成熟SUMO2和SUMO3蛋白之间的高度同源性，推测识别抗SUMO2抗体的疾也可能同时识别抗人SUMO3抗体，这有待后续实验进一步考证。抗人SUMO3抗体针对源自人SUMO-3蛋白的C末端区域的合成肽产生。与人SUMO3蛋白反应，也称为SMT3A，SMT3h1或Sentrin3。在WesternBlots上，它识别出一个约18kD的单个波段。在~25kD，~35kD及以上可观察到几个未知来源的条带。已经用SK-OV3人卵巢腺癌或Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞裂解物证实了反应性。

制备^[1]

抗人SUMO3抗体制备如下：

1）引物的设计与合成　

利用NCBI找到SUMO3　蛋白的编码序列，设计引物对目的片段进行PCR扩增。SUMO3蛋白上游引物FP：TTA　AGA　AGG　AGA　TAT　ACC　ATG　TCCGAG　GAG　AAG　CCC　AAA　GAG，下游引物RP：GTG　GTG　GTG　GTG　GTG　CTC　GAG　GAA　ACTGTG　CCC　TGC　CAA　GCT。

2）人SUMO3基因原核表达载体的构建　

利用聚合酶链式反应（PCR）扩增3种目的蛋白的DNA片段。PCR反应体系为：95℃，预变性3miN，95℃变性30s、60℃复性30s、72℃延伸35s、30个循环后72℃5miN终止反应。选择已构建好的含His标签序列的pET－28A质粒，根据多克隆位点以NCOI和XHOI作为酶切位点，对该质粒进行双酶切。将扩增的PCR产物和酶切后的质粒混合，导入GB05-DiR大肠杆菌培养。通过卡纳抗性筛选阳性单克隆，经PCR进行菌落扩增。采用成品试剂盒对过夜培养的菌种提取含目的DNA片段的重组质粒，采用紫外分光光度计测试其浓度。

3）人SUMO3蛋白在大肠杆菌中的诱导表达　

将测序正确的人SUMO3重组质粒转化至BL21－DE3，选取阳性单克隆于液体培养基37℃振荡培养至OD值约为0．6。在诱导剂IPTG（1M／L）的条件下分别于37℃摇床培养4H和25℃摇床过夜。收获不同条件下的菌液，SDS－PAGE电泳检测。最终确定菌种的最适诱导表达条件为37℃摇床培养4H。

4）人SUMO3蛋白表达产物分离与纯化　

将置于-80℃冰箱保存的菌体取出，用20Ml 5mm咪唑（作为裂解缓冲液）（Lysis　Buffer）重悬。期间按1∶500添加PMSF以防止蛋白降解。再按1∶100添加溶菌酶（1M／L），之后每隔5min涡旋振荡1次，冰上孵育30min。超声破菌，功率36％，每次工作2s，间歇3s，待上清液澄清可透光提示破菌完成。采用亲和层析柱和超滤管进行蛋白的纯化。为防止蛋白降解，在超滤之后需将目的蛋白分装到若干个EP管中，做冷干，制成蛋白干粉并置于-80℃超低温冰箱长久保存。

主要参考资料

[1] 抗SＵMＯ抗体在原发性胆汁性胆管炎临床诊疗中的价值