人乳腺成纤维细胞的应用

背景^[1-3]

人乳腺成纤维细胞是一种在乳腺组织中发挥重要功能的细胞类型。成纤维细胞是由胚胎时期的间充质细胞分化而来，是疏松结缔组织的主要细胞成分。在乳腺中，成纤维细胞负责提供支持和营养给乳腺组织，同时也在乳腺的发育、泌乳和损伤修复过程中发挥关键作用。

人乳腺成纤维细胞在形态上呈扁平状，有突起，胞质嗜弱碱性。在功能上，成纤维细胞具有蛋白质合成和分泌活动，可以分泌多种生长因子和细胞因子，对乳腺组织的生长和发育起到调节作用。同时，成纤维细胞也在乳腺的免疫调节、创伤修复和肿瘤发生中发挥重要作用。

近年来，随着干细胞和组织工程的研究进展，人乳腺成纤维细胞已成为研究乳腺发育、再生医学和肿瘤发生的重要工具。通过研究成纤维细胞在乳腺组织中的作用机制，可以为乳腺癌的预防和治疗提供新的思路和方法。

人乳腺成纤维细胞

人乳腺成纤维细胞培养操作

1)复苏人乳腺成纤维细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)人乳腺成纤维细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)人乳腺成纤维细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

人乳腺成纤维细胞可以用于IL-13对人乳腺成纤维细胞在乳腺肿瘤微环境中IKK/NFκBp65表达的影响

探索IL-13对人乳腺成纤维细胞在乳腺肿瘤微环境中IKK/NFκBp65基因表达的影响，为进一步深入研究乳腺肿瘤的发生和发展提供理论和实验基础。

方法：通过对人乳腺癌细胞与成纤维细胞共培养，体外模拟建立乳腺肿瘤微环境，采用实时-PCR，检测成纤维细胞IKK和NFκBp65的mRNA表达变化。运用免疫细胞化学，检测成纤维细胞IKK和NFκBp65的蛋白表达。

结果：1.不同浓度的IL-13(5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、100ng/ml)刺激与人乳腺癌细胞MDA-MB-435共培养的人乳腺成纤维细胞Hs578Bst，采用实时-PCR检测成纤维细胞IKK和NFκBp65mRNA的表达。结果显示，IL-13100ng/ml组IKK mRNA的表达与对照组比较，无显著性差异（P>0.05），IL-135ng/ml、10ng/ml、20ng/ml各组IKK mRNA表达上调（P<0.05)；IL-135ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、100ng/ml各组NFκBp65mRNA表达上调（P<0.05)。

2. 不同浓度的IL-13(5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、100ng/ml)刺激非共培养的人乳腺成纤维细胞Hs578Bst，采用实时-PCR检测成纤维细胞IKK和NFκBp65mRNA的表达。结果显示，各实验组IKK mRNA的表达下调（P<0.05)；各实验组成纤维细胞NFκBp65mRNA的表达上调(P<0.05)。

3. 不同浓度的IL-13（5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、100ng/ml）的作用下，共培养的成纤维细胞IKK mRNA的表达高于非共培养的各同浓度组（P<0.05）；IL-1310ng/ml组共培养成纤维细胞NFκBp65mRNA的表达高于同浓度组非共培养成纤维细胞NFκBp65mRNA的表达（P<0.05），其它共培养组（IL-135ng/ml、20ng/ml、100ng/ml组）成纤维细胞NFκBp65mRNA的表达均低于同浓度组非共培养成纤维细胞NFκBp65mRNA的表达（P<0.05）。

4. 免疫细胞化学结果显示，在乳腺肿瘤细胞共培养条件下成纤维细胞IKK和NFκBp65的蛋白表达高于非共培养组（P<0.05）。

结论：1.乳腺肿瘤微环境和IL-13的共同作用上调人乳腺成纤维细胞IKK的表达；与人乳腺癌细胞株MDA-MB-435共培养的人乳腺成纤维细胞株Hs578BsIKK的表达高于非共培养的人乳腺成纤维细胞株Hs578Bs。2.IL-13浓度为10ng/ml与乳腺肿瘤细胞微环境形成较好的协同作用；上调与人乳腺癌细胞株MDA-MB-435共培养的人乳腺成纤维细胞株Hs578BsNFκBp65的表达。

参考文献

[1]Why does chronic inflammation persist:An unexpected role for fibroblasts[J].Christopher D.Buckley.Immunology Letters,2011(1)

[2]Interleukin 13 expression in the primary breast cancer tumor tissue[J].Nahida Srabovic;;Zlata Mujagic;;Jasminka Mujanovic-Mustedanagic;;Zdeno Muminovic;;Adaleta Softic;;Lejla Begic.Biochemia Medica,2011(2)

[3]The autophagic tumor stroma model of cancer or“battery-operated tumor growth”[J].Ubaldo E.Martinez-Outschoorn;;Diana Whitaker-Menezes;;Stephanos Pavlides;;Barbara Chiavarina;;Gloria Bonuccelli;;Casey Trimmer;;Aristotelis Tsirigos;;Gemma Migneco;;Agnieszka K.Witkiewicz;;Renee M.Balliet;;Isabelle Mercier;;Chengwang Wang;;Neal Flomenberg;;Anthony Howell;;Zhao Lin;;Jaime Caro;;Richard G.Pestell;;Federica Sotgia;;Michael P Lisanti.Cell Cycle,2010(21)

[4]Nonresolving Inflammation[J].Carl Nathan;;Aihao Ding.Cell,2010(6)

[5]张明静.IL-13对人乳腺成纤维细胞在乳腺肿瘤微环境中IKK/NFκBp65表达的影响[D].南昌大学,2014.