小鼠椎间盘髓核细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠椎间盘髓核细胞是一种常用的实验细胞，取自小鼠的椎间盘组织。这种细胞在科学研究中有广泛的应用，尤其是在研究椎间盘退行性疾病的机制和探索潜在的治疗方法方面。

小鼠椎间盘髓核细胞具有一些独特的形态和生长特性。在显微镜下，这些细胞通常呈现梭形或多角形的外观，具有不规则的形状。这些细胞在培养条件下贴壁生长，可以通过传代方式进行扩增。

为了保持小鼠椎间盘髓核细胞的正常生长和特性，需要使用适合的培养基和培养条件。推荐使用EliteCell原代软骨细胞培养体系作为体外培养原代髓核细胞的培养基。此外，还需要注意控制温度和气体比例等培养条件。

在实验中，小鼠椎间盘髓核细胞可以用于各种类型的分析，如基因表达、蛋白质功能和药物筛选等。这些分析有助于深入了解椎间盘退行性疾病的发病机制，并探索潜在的治疗方法。

小鼠椎间盘髓核细胞

小鼠椎间盘髓核细胞培养操作

1)复苏小鼠椎间盘髓核细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)小鼠椎间盘髓核细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)小鼠椎间盘髓核细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

小鼠椎间盘髓核细胞可以用于小鼠椎间盘源性腰痛动物模型构建以及VEGF/VEGFR1信号在椎间盘源性腰痛发病中的作用及机制研究

研究背景椎间盘退变过程伴随新生血管形成及VEGF表达增高,既往研究发现血管内皮细胞生长因子受体1(VEGFR1)参与癌症性疼痛的调节,我们上一部分模型发现椎间盘内VEGF及背根神经节中VEGFR1表达显著增加,提示VEGF/VEGFR1信号可能参与椎间盘源性腰痛的发病过程,但目前尚无相关研究报道。

研究目的：探讨VEGF/VEGFR1信号在小鼠椎间盘源性腰痛中的作用及机制。

研究方法：1、以VEGFR1酪氨酸激酶敲除(VEGFR1-TK-/-)鼠及野生型鼠为研究对象,按第一部分所述方法构建小鼠椎间盘源性腰痛模型。

2、采用疼痛测量方法对比两组小鼠术后疼痛行为改变情况,包括机械性和热刺激痛觉过敏及Burrowing行为变化。

3、术后12周micro-CT和组织学染色评估两组小鼠椎间盘退变程度,免疫荧光染色评估两组小鼠椎间盘内小鼠椎间盘髓核细胞NGF表达差异、DRG中疼痛相关基因(CGRP、NGF、TRPV1、TRPA1)表达变化、以及脊髓中胶质细胞激活状况。

4、体外培养小鼠椎间盘髓核细胞及纤维环细胞,给予VEGF和/或si RNA-VEGFRs干预24小时,采用RT-PCR方法检测Adamts-5、MMP-13、NGF的表达变化。

5、体外分别培养VEGFR1-TK-/-鼠和野生型鼠的DRG神经元细胞以及DRG和脊髓器官培养,给予VEGF干预后采用细胞免疫荧光及q RT-PCR法对比分析DRG中疼痛相关基因的表达差异,采用q RT-PCR法检测脊髓中胶质细胞特异性标志基因GFAP和CD11b的表达差异。

四、研究结果1、椎间盘损伤术后VEGFR1-TK-/-小鼠机械性及热刺激缩爪阈值显著高于野生型鼠,Burrowing数量较野生型鼠显著增加。2、VEGFR1-TK-/-鼠和野生型鼠术后第12周椎间盘均发生严重退变,但两组之间无显著差异;VEGFR1-TK-/-鼠椎间盘内NGF表达水平较野生型鼠低,DRG中疼痛相关神经肽(CGRP、NGF、TRPV1和TRPA1)表达上调幅度以及脊髓中星形胶质细胞激活程度均显著低于野生型鼠。3、VEGF可显著上调小鼠椎间盘髓核细胞和纤维环细胞中NGF、Adamts-5、和MMP-13的表达,si RNA-VEGFR1可显著阻断VEGF对NGF的上调作用,而si RNA-VEGFR2可显著逆转VEGF对Adamts-5和MMP-13的上调效应。

五、研究结论VEGFR1酪氨酸激酶敲除可显著缓解小鼠椎间盘损伤后出现的椎间盘源性腰痛症状,其机制可能与损伤后椎间盘内NGF表达上调幅度、DRG中疼痛神经肽表达增加幅度、以及脊髓后角中胶质细胞激活程度降低有关;体外实验结果提示VEGF可通过VEGFR1介导椎间盘小鼠椎间盘髓核细胞NGF表达以及介导DRG和脊髓中疼痛信号的传导。

参考文献

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