RAT1 大鼠成纤维细胞系的应用

背景^[1-3]

RAT1大鼠成纤维细胞系是细胞生物学中的一种细胞系，由特定的实验条件和培养方法得到。它是一种特定的细胞系，主要用于科学研究，以探索细胞生长、分化、代谢等方面的机制。

Rat1大鼠成纤维细胞系在研究中具有一定的应用价值，例如在药物筛选、毒理学研究、基因功能研究等领域中都发挥着重要作用。通过使用Rat1大鼠成纤维细胞系，科学家们可以更好地了解细胞生长和分化的过程，探索药物的作用机制，以及研究基因对细胞生长和分化的影响等。

RAT1大鼠成纤维细胞系

RAT1大鼠成纤维细胞系细胞培养操作

1)复苏RAT1大鼠成纤维细胞系细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)RAT1大鼠成纤维细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)RAT1大鼠成纤维细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

RAT1大鼠成纤维细胞系可以用于糖尿病大鼠来源成纤维细胞外泌体对创面愈合的影响

研究糖尿病大鼠来源的成纤维细胞外泌体对创面愈合的影响,并通过miRNA测序,预测关键信号分子,最终从外泌体角度揭示导致糖尿病创面不愈合的分子机制。

方法:将30只150g左右SD大鼠编号,之后按照随机数表随机分为实验组和对照组,实验组大鼠注射55 mg/kg链脲佐菌素柠檬酸盐缓冲液,对照组注射等量柠檬酸盐缓冲液。7天后测量大鼠体重、血糖、饮水量和尿量,以血糖大于16.7mmol/L,体重较对照组明显减轻,饮水量和尿量较对照组显著增多为建模成功指标,持续建模12周后用于实验。用组织贴壁法分别提取实验组及对照组大鼠背部皮肤的成纤维细胞,传代培养细胞至P3代。用不含外泌体的血清与DMEM配置成完全培养基,培养P3代大鼠成纤维细胞,并收集细胞上清。将收集的细胞上清用超滤管浓缩后,装入超速离心管,差数离心提取外泌体,并将获得的外泌体做电镜、纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)、western-blot检测鉴定。用CCK-8检测糖尿病大鼠来源成纤维细胞外泌体(Diabetes Exosome)较RAT1大鼠成纤维细胞系外泌体(Normal Exosome)对人角质形成细胞系(HEK-a)和人微血管内皮细胞系(HMEC-1)细胞增值的影响。

建立大鼠背部全层皮肤创面模型,观察糖尿病大鼠来源成纤维细胞外泌体和正常大鼠来源成纤维细胞外泌体较PBS对照组,对大鼠创面愈合的影响。分别提取糖尿病大鼠来源和RAT1大鼠成纤维细胞系外泌体总RNA,进行miRNA测序。然后,对已知miRNA进行差异表达分析,并预测所得差异miRNA的靶基因信息。根据预测结果对靶基因进行功能注释及富集分析。结果:糖尿病诱导的大鼠中,有10只符合建模成功的标准。实验组的大鼠,体重较对照组显著减少,血糖值、每日饮水量和尿量较对照组显著增高。提取的成纤维细胞原代呈细长梭形,胞浆透亮丰富。外泌体透射电镜可见典型的外泌体双层膜结构。NTA提示所得外泌体直径在50-200nm,符合要求。外泌体western-blot提示,测得外泌体阳性指标热休克蛋白90(HSP90)、热休克蛋白70(HSP70)较细胞对照组增高,外泌体阴性指标GM130、β-tubulin未测得。CCK-8检测,加入Diabetes Exosome及Normal Exosome后,HEK-a和HMEC-1在450nm处吸光度较对照组均有显著增高。

参考文献

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