人视网膜母细胞瘤的应用

背景^[1-3]

人视网膜母细胞瘤（Retinoblastoma，RB）是一种起源于视网膜细胞的恶性肿瘤，是儿童最常见的原发性眼内恶性肿瘤。视网膜母细胞瘤可发生于任何年龄，但绝大多数发生于3岁以前，可单眼、双眼先后或同时发病。由于该肿瘤具有家族遗传倾向，因此有家族史的患儿风险较高。

人视网膜母细胞瘤的临床表现多样，早期症状可能包括视力减退、瞳孔散大、白瞳症等。随着病情的发展，可能出现眼球突出、斜视、眼痛等不适。在疾病的晚期，肿瘤可能转移到脑部或其他器官，导致相应的症状。

人视网膜母细胞瘤的诊断主要依据临床表现、眼部检查和必要的实验室检查。治疗方式包括手术切除、放疗、化疗等，治疗原则是在保证患儿生存率的前提下，尽可能保留眼球、挽救视力。对于高危家系的患儿，基因检测和遗传咨询也是必要的。

人视网膜母细胞瘤

人视网膜母细胞瘤细胞培养操作

1)复苏人视网膜母细胞瘤细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)人视网膜母细胞瘤细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)人视网膜母细胞瘤细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

人视网膜母细胞瘤可以用于METTL3在视网膜母细胞瘤中对顺铂耐药的作用及机制研究

研究METTL3基因在人视网膜母细胞瘤Y79及其耐顺铂细胞株Y79/DDP中表达情况,探讨METTL3在耐顺铂细胞株Y79/DDP中的作用及潜在的分子作用机制,为预防人视网膜母细胞瘤临床治疗中的顺铂抗性提供见解。

方法:我们对ARPE-19(人正常视网膜色素上皮细胞)、人视网膜母细胞瘤Y79及Y79/DDP三个细胞系进行Real-Time PCR、Western Blot实验,验证METTL3为差异表达基因。将过表达或敲低METTL3基因的慢病毒载体转染到人视网膜母细胞瘤Y79中,构建过表达或敲低METTL3的稳转株,并通过Real-Time PCR、Western Blot实验检测其m RNA、蛋白表达水平。使用MTT实验检测不同浓度顺铂在人视网膜母细胞瘤Y79过表达及敲低METTL3时增殖的影响。通过Me RIP-seq及Me RIP-q PCR明确METTL3在Y79中的靶基因,进一步在体外通过Real-Time PCR、Western Blot、流式细胞学等实验检测METTL3对相关靶基因的调控作用。

结果:在本研究中,我们发现METTL3在人视网膜母细胞瘤Y79、Y79/DDP中表达水平均上调;在Y79细胞中过表达METTL3促进其增殖,同时可增强其对顺铂的耐药,敲低METTL3则抑制细胞生长及其对顺铂的耐药;机制研究表明,METTL3在人视网膜母细胞瘤Y79中通过靶向MDM2促进其对顺铂的耐药,还可通过靶向铂类耐药相关基因BCL2,抑制Y79细胞凋亡,促进Y79对顺铂的耐药。

结论:我们的研究结果显示METTL3在视网膜母细胞瘤化疗耐药中起重要作用,其可通过靶向铂类耐药相关基因MDM2、BCL2,调控人视网膜母细胞瘤Y79细胞对顺铂的耐药作用,METTL3可能作为视网膜母细胞瘤潜在的诊断生物标志物及治疗靶点。

参考文献

[1]Long noncoding RNAs as promising biomarkers in cancer[J].Beylerli Ozal;Gareev Ilgiz;Sufianov Albert;Ilyasova Tatiana;Guang Yang.Non-coding RNA Research,2022

[2]Long non-coding RNA NCK1-AS1 is overexpressed in esophageal squamous cell carcinoma and predicts survival.[J].Fu Xin;Chen Xi;Si Yuanyuan;Yao Youjie;Jiang Zhengming;Chen Kui.Bioengineered,2022

[3]pRB-Depleted Pluripotent Stem Cell Retinal Organoids Recapitulate Cell State Transitions of Retinoblastoma Development and Suggest an Important Role for pRB in Retinal Cell Differentiation.[J].Rozanska Agata;CernaChavez Rodrigo;Queen Rachel;Collin Joseph;Zerti Darin;Dorgau Birthe;Beh Chia Shyan;Davey Tracey;Coxhead Jonathan;Hussain Rafiqul;AlAama Jumana;Steel David H;Benvenisty Nissim;Armstrong Lyle;Parulekar Manoj;Lako Majlinda.Stem cells translational medicine,2022

[4]Downregulation of miR-211-5p Promotes Carboplatin Resistance in Human Retinoblastoma Y79 Cells by Affecting the GDNF–LIF Interaction[J].Ke Ning;Chen Lin;Liu Qing;Xiong Haibo;Chen Xinke;Zhou Xiyuan.Frontiers in Oncology,2022

[5]郭惠峰.METTL3在视网膜母细胞瘤中对顺铂耐药的作用及机制研究[D].南昌大学,2023.