刚地弓形虫PCR试剂盒的应用

背景^[1-3]

刚地弓形虫PCR试剂盒是一种用于检测刚地弓形虫的实验工具，采用聚合酶链式反应（PCR）技术进行检测。该试剂盒具有高灵敏度和特异性，能够快速、准确地检测出刚地弓形虫，对于该病的诊断和治疗具有重要意义。

刚地弓形虫是一种常见的寄生虫，可引起人类和动物的感染。刚地弓形虫病是一种全球性分布的人兽共患病，可导致严重的症状甚至死亡。因此，对刚地弓形虫进行快速、准确的检测对于诊断和治疗该病具有重要意义。

刚地弓形虫PCR试剂盒的组成通常包括引物、Taq酶、dNTPs等必要的PCR反应成分，以及可能包含的各种成分如染料、缓冲液、特异性结合探针等。引物是PCR反应的关键成分，它们与刚地弓形虫基因的特定区域结合，从而启动DNA的扩增过程。Taq酶是一种耐热的DNA聚合酶，能够催化DNA的合成。dNTPs是合成DNA的基本原料。

使用刚地弓形虫PCR试剂盒进行检测时，首先需要采集感染刚地弓形虫的样本，如血液、组织或其他相关样本。将样本中的DNA或RNA与试剂盒中的引物和Taq酶等成分混合，进行PCR反应。反应过程中，DNA或RNA会不断扩增，最终形成大量的特定基因片段。通过凝胶电泳等技术对这些片段进行分析，可以判断出是否存在刚地弓形虫基因，从而确定患者是否感染该寄生虫。

刚地弓形虫PCR试剂盒具有高灵敏度和特异性，能够在极低浓度下检测出刚地弓形虫基因。此外，该试剂盒还具有快速、简便、易于操作等特点，可以广泛应用于临床诊断和实验室检测领域。然而，试剂盒也存在一定的局限性，如对实验条件和操作要求较高，可能出现假阳性或假阴性结果等问题，需要在使用时注意。

刚地弓形虫PCR试剂盒

刚地弓形虫PCR试剂盒的操作步骤如下：

1.样本采集：从患者体内采集血液、粪便、组织等样本，并将其保存在无菌容器中。

2.DNA提取：将采集到的样本进行DNA提取，通常采用柱式或磁珠式DNA提取试剂盒。提取后的DNA应保存在-20°C或更低的温度下。

3.PCR反应体系准备：根据刚地弓形虫PCR试剂盒的要求，配制PCR反应体系，包括引物、荧光探针、dNTPs、DNA聚合酶等。

4.PCR反应：将提取的DNA加入到PCR反应体系中，进行PCR反应。反应条件和时间根据试剂盒说明书的要求进行设置。

5.结果分析：将PCR反应后的产物进行荧光信号检测，根据荧光信号的出现情况判断是否存在刚地弓形虫的感染。

应用^[4-5]

刚地弓形虫PCR试剂盒可以用于两株猪源刚地弓形虫的分离及其生物学特性的研究

1、刚地弓形虫PCR试剂盒PCR检测方法的建立国际标准株RH株经腹腔接种ICR小鼠,3～5d后采集小鼠腹水,经CF-11纤维素柱纯化速殖子,提取虫体DNA。以B1基因和529bp重复片段序列做为靶点基因,分别进行了单基因和双基因PCR扩增,并优化PCR反应体系。结果表明529重复片段比B1基因的敏感性高10倍,前者相当于可检测0.9个速殖子,后者可检测9个速殖子；双重PCR可检测到约90个速殖子。

2、猪源弓形虫虫株的分离对临床上出现高温、呼吸困难等症状以及剖检在肝脏、肺脏、淋巴结、肠道等有出血、坏死等病变的兽医院门诊病猪进行了弓形虫检测。从25例病死猪中检出5例阳性,阳性率达20%。对检测为阳性的病死猪取脏器组织用ICR小鼠传代,进行虫体分离。取死亡小鼠腹水染色镜检,可见较多月牙形、半月形或椭圆形的虫体,还可见假包囊。成功分离出2株虫体,分离成功率为40%。两株分离株分别命名为YZ-1(家养野猪)和YZ-2(商品猪)。

3、两株猪源刚地弓形虫的鼠毒力分析将2株分离株在小鼠体内连续传代,且传代时每次经腹腔接种的虫体数相同,直至虫体在小鼠稳定寄生。以RH株为参考株,每个虫株各设5个剂量组,分别经腹腔接种梯度稀释的速殖子。结果表明分离的2株猪源弓形虫分离株对小鼠的毒力与RH株相同,经腹腔接种10个速殖子致小鼠100%的死亡,且死亡发生规律与RH株相似,因此将这2株猪源弓形虫分离株鉴定为鼠毒力株。但2株猪源弓形虫分离株GRA6基因的克隆与序列分析显示,GRA6基因序列中同时存在15bp和3bp片段的缺失,与鼠弱毒株(BEVERLEY)的完全一致。

4、两株猪源刚地弓形虫的基因型分析采用刚地弓形虫PCR试剂盒PCR-RFLP方法,以GRA6,PK1,SAG2,c29-2,SAG3,BTUB,c22-8,L358,Apico等9个常用分型基因位点对两株猪源弓形虫分离株进行基因型分析,结果显示,分离的两株猪源弓形虫的基因型完全一致,为非经典型(atypical),与报道的中国猫源株中Chinese1基因型完全一致。另外,两株猪源弓形虫分离株在PK1、GRA6和SAG2三个基因位点上的基因型均为Ⅱ型,且在进化树分析中也显示与基因Ⅱ型聚合在一个分支。

5、两株猪源刚地弓形虫的ITS区序列分析对两株猪源弓形虫分离株的ITS及5.8S基因进行了克隆及序列分析,并与GenBank上登录的RH株及其他弓形虫株的ITS序列进行比较,结果表明弓形虫种内ITS序列存在极少变异,具有高度保守性。对弓形虫及外源参考群的ITS和ITS-1序列构建N-J进化树分析,结果显示ITS序列适于弓形虫与其他原虫的种间鉴定,但不适合用于弓形虫种内遗传变异的研究。

参考文献

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