RNAi载体设计与构建的相关介绍

背景及概述^[1]

RNAi是一种在dsRNA参与指导下，以外源和内源mRNA为降解目标的，具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象，它表现为这些基因发生了转录产生了mRNA，但是很快被降解而不能在细胞内积累，最终使相应的基因得不到表达而表现基因沉默。RNAi现象被发现后，许多学者便对其形成机制进行了大量研究。双链RNA在线虫中引起的RNAi现象不仅可以从双链RNA的注射部位传递到线虫的身体各处，而且还可以从线虫的父代传给子代。这些现象让科学家们猜测，RNAi作用可能是由一类较稳定的中间介质来实现的。在生化方面的研究进一步揭示了RNAi的转录后基因沉默（PostTranscriptionalGeneSilencing，PTGS）的机制。在用转基因或病毒诱导出PTGS的植物中发现了一种长为25个核苷酸（25nt）小片段RNA分子。这些小片段RNA分子可以通过序列互补与相应的mRNA结合，从而引起mRNA的降解，而在未发生PTGS的植物体内则无此发现，揭示了这种小片段RNA与PTGS的发生有密切关系。之后，有人将外源性dsRNA加入果蝇胚胎提取物中，发现dsRNA的两条链均被降解成21-23nt的RNA片段，这一过程不依赖于靶mRNA序列的存在，而含有这种片段的胚胎提取物又能将与dsRNA同源的mRNA降解成为21-23nt的小片段RNA，表明dsRNA降解形成的小片段RNA具有介导同源mRNA降解的作用。

RNAi载体设计与构建包括设计与构建两个方面

1. RNAi载体设计与构建中设计过程如下：有研究以pCDNA3.1(+)载体为基本骨架,在其转录单元的5’端添加了一个自剪切的HDV核酶用于切掉转录后的5’帽子和其基因编码序列的3’端添加了一个自剪切的烟草环斑病毒发夹状核酶用于将3’polyA切掉,又在发夹状核酶下游添加了一个加尾信号BGHpA(牛生长激素加尾信号)。为了更加保险的防止通读现象的发生在BGHpA加尾信号下游添加了一个自我剪切的烟草环斑病毒核酶和能够延缓RNA聚合酶Ⅱ转录的人β-actin基因(Humanβ-actingene)减速序列。为以后用G418筛选得到稳定表达长双链干扰RNA的细胞系,又将整个结构转移到已经改造好的装有新霉素抗性基因(Neomycin)表达结构的的pBluescriptⅡSK(+)载体中。

2. RNAi载体设计与构建中构建过程：RNAi载体的构建需对各种载体质粒进行相应的限制性酶切位点修饰再通过使用T4连接酶进行连接，而后进行重组质粒的连接转化质粒提取，已及重组质粒的酶切鉴定等一系列的过程。具体步骤如下：

1) pcDNAHDVCoTC载体的构建

将已经提取好的由上海生工合成合成的HDV序列并克隆到pBluescriptIISk的SacI和BamHI酶切位点之间的载体质粒和pCDNA3.1（+）载体使分别同时用限制性内切酶SacⅠ和BamHI双酶切，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收酶切产物，将两个片段进行连接，命名为pcDNAHDVCoTC。酶切反应体系：在1.5mL离心管中加入以下试剂，建立60µL反应体系：

37℃反应3h后，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收酶切产物。连接反应体系：在1.5mL离心管中加入以下试剂，建立10µL反应体系：

16℃连接过夜，次日进行转化，转化后16-18h后用灭菌牙签挑取单克隆进行画线，同时将其投入加入抗生素的LB培养基的小玻璃试管，37℃剧烈摇菌过夜，按照前面叙述的质粒提取方法进行质粒的小量提取，及酶切鉴定。

2)pcDNAHDVCoTC-5RZ载体的构建

用XhoⅠ和XbaI双切构建好的pcDNAHDVCoTC质粒回收其载体部分和前面已经退火连接好的作为外源片段的HHRF片段，将两者连接，获得pcDNAHDVCoTC-5RZ载体。此处重组质粒需测序鉴定，挑选2个单克隆送上海生工进行测序。

3)pcDNAHDVCoTC-5RZ-ACTPs载体的构建

将PCR产物与T载体测序正确的阳性重组克隆质粒（Humanβ-globingene-T）和测序正确的阳性重组克隆pcDNAHDVCoTC-5RZ质粒同时用限制性内切酶ApaⅠ和PmeI双酶切回收外源片段和载体片段，将两者连接，获得pcDNAHDVCoTC-5RZ-ACTPs载体。

4)pcDNAHDVCoTC-5RZ-PA-ACTP载体的构建

将pIRES-Neo载体和鉴定正确的pcDNAHDVCoTC-5RZ-ACTPs重组克隆载体，同时使用限制性内切酶XbaⅠ和XhoI双酶切这两个载体，并回收外源片段和载体片段将其两者连接，获得pcDNAHDVCoTC-5RZ-PA-ACTP载体。

5)pcDNAHDVCoTC-5RZ-PA-3RZ-ACTP载体的构建

用限制性内切酶XhoⅠ和NheI双酶切构建好的pcDNAHDVCoTC-5RZ-PA-ACTP质粒载体，回收其载体部分和前面已经退火后形成互补片段HHRF作为外源片段，将其两者进行连接，获得pcDNAHDVCoTC-5RZ-PA-3RZ-ACTP载体。

6)Psv40Neo载体的构建

用HindⅢ切割PMCS载体，回收酶切产物使用KlenowFragment补平后，再次回收补平产物后，再用XhoⅠ切割回收的补平产物，此回收产物作为载体片段与用限制性内切酶XhoⅠ和NheI双酶切构建好的pcDNAHDVCoTC-5RZ-PA-3RZ-ACTP质粒载体回收的大约1.515Kb的外源片段，将两者连接，获得Psv40Neo载体。。选择鉴定正确的克隆提好质粒-20℃保存备用以便进行后续试验。

7)RNA干扰用PMCSHDVCoT-5RZ-PA-3RZ-ACTP载体的获得

用SalⅠ切割鉴定正确的Psv40Neo载体，回收酶切产物使用KlenowFragment补平，回收补平产物再用BglⅡ切割回收的补平产物，此回收产物作为载体片段与用BglⅡ和PmeI双酶切构建好的pcDNAHDVCoTC-5RZ-PA-3RZ-ACTP质粒载体回收的大约1.944Kb的外源片段，将两者连接，获得RNA干扰用PMCSHDVCoT-5RZ-EGFP-PA-3RZ-ACTP载体。

主要参考资料

[1]RNA聚合酶Ⅱ识别的启动子表达长dsRNA的RNAi载体的设计与构建