大鼠视网膜MULLER细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠视网膜MULLER细胞是一种特殊的胶质细胞，是视网膜中最重要的支持细胞之一。它们主要负责维持视网膜的正常结构和功能，同时也可以在视网膜损伤或疾病时发挥保护和修复作用。

MULLER细胞在视网膜中广泛分布，它们具有长突起，可以延伸到视网膜的各个部分，与神经元和其他胶质细胞相互作用。它们通过调节水分子的运输和代谢，以及传递营养物质和信号分子，来维持视网膜的正常代谢和功能。

大鼠视网膜MULLER细胞是一种神经元细胞，位于大鼠视网膜的神经元网络中。它们与其他神经元一起构成了视觉通路，负责将光信号转换为神经信号并传递到大脑中进行处理。

MULLER细胞通常具有长而细的轴突，这些轴突延伸到视网膜内部并与其他神经元形成突触连接。它们的主要功能是接收来自其他神经元的信号，并将其传递到下一个神经元或脊髓中进行处理。

除了视觉通路外，MULLER细胞还与其他神经元相互作用，参与调节睡眠、运动控制和疼痛感知等生理过程。例如，它们可以与下丘脑内的食欲调节中枢相互作用，控制食欲和能量代谢；也可以与下丘脑内的性行为中枢相互作用，调节性行为和生殖功能。

在视网膜疾病或损伤时，MULLER细胞可以分泌多种生长因子和细胞因子，促进受损视网膜细胞的再生和修复，同时也可以抑制炎症反应和细胞凋亡等不良生理反应。因此，研究MULLER细胞的功能和作用机制，可以为治疗视网膜疾病提供新的思路和方法。

大鼠视网膜MULLER细胞

大鼠视网膜MULLER细胞培养操作

1)复苏大鼠视网膜MULLER细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)大鼠视网膜MULLER细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)大鼠视网膜MULLER细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

大鼠视网膜MULLER细胞可以用于褪黑素对糖尿病视网膜病变的保护作用及机制研究

运用生物化学,分子生物学等方法,通过原代培养大鼠视网膜MULLER细胞,建立糖尿病大鼠模型,从细胞水平和整体水平探讨褪黑素对糖尿病视网膜病变的保护作用,并进一步深入研究其作用机制,将为以后进行糖尿病视网膜保护新药的研发及药物的临床试验提供理论依据,为糖尿病视网膜病变的治疗提供新的途径。

褪黑素对高糖所致视网膜Muller细胞损伤的保护作用及其机制研究目的：探讨褪黑素是否对高糖所致视网膜Muller细胞损伤具有保护效应,并进一步研究其作用通路。

方法：酶消化法分离培养大鼠视网膜MULLER细胞,免疫荧光法鉴定细胞性质和纯化度。细胞免疫荧光法检测Muller细胞褪黑素膜受体的分布。细胞分为低糖对照组(5.5mmol/l)、甘露醇对照组(5.5mmol/l+24.5mmol/l甘露醇)、高糖组(30mmol/l)、褪黑素+高糖组,褪黑素+高糖+P13k抑制剂(LY294002)组,褪黑素+高糖+褪黑素膜受体拮抗剂(Luzindole)组,分别用不同浓度的褪黑素干预(0.1umol/L,lumol/L,10umol/L,100umol/L),在干预不同时间(24h,48h,72h)后用Western Blot技术检测细胞中磷酸化的Akt水平,免疫荧光检测Nrf2的核转位,用Real time RT-PCR及Western Blot技术检测HO-1,GCLc,GCLm,IL-1β,TNF-α,NF-κB的表达,ELISA法检测VEGF水平,综合分析褪黑素的保护作用。

结果：酶消化法体外分离培养大鼠视网膜MULLER细胞纯化度高。视网膜Muller细胞存在褪黑素膜受体MT1,MT2分布,且在高糖条件下受体表达升高。褪黑素可以诱导Akt的磷酸化,提高Nrf2及抗氧化酶H0-1,GSH,GCLc,GCLm的表达水平,促使Nrf2发生核转位,同时抑制高糖状态下显著提高的VEGF水平。而这些效应可被褪黑素膜受体拮抗剂Luzindole及P13K抑制剂LY294002部分阻断。高糖条件下,细胞内炎症因子IL-1β,TNF-α,NF-κB水平显著升高,褪黑素可降低其表达。

结论：褪黑素对高糖所致大鼠视网膜MULLER细胞损伤具有抗氧化及抗炎保护作用,主要体现在可以提高抗氧化酶水平以及抑制炎症因子表达。PI3K/Akt-Nrf2通路及褪黑素膜受体参与其抗氧化效应的实现,NF-K B在其抗炎效应中发挥重要作用。同时褪黑素可以抑制VEGF的表达。

参考文献

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[2]Role of Intravitreal Inflammatory Cytokines and Angiogenic Factors in Proliferative Diabetic Retinopathy[J].Jinzi Zhou;;Shuhong Wang;;Xiaobo Xia.Current Eye Research,2012(5)

[3]IL-12 concentrations in the aqueous humor and serum of diabetic retinopathy patients[J]..Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology,2012(6)

[4]Inflammation in diabetic retinopathy[J].Johnny Tang;;Timothy S.Kern.Progress in Retinal and Eye Research,2011(5)

[5]蒋婷婷.褪黑素对糖尿病视网膜病变的保护作用及机制研究[D].复旦大学,2016.