NCI-H2052人恶性胸膜间皮瘤贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

NCI-H2052人恶性胸膜间皮瘤贴壁细胞系是一种用于研究人恶性胸膜间皮瘤的细胞系。这种细胞系是通过将恶性胸膜间皮瘤的肿瘤组织进行体外培养而获得的。

NCI-H2052人恶性胸膜间皮瘤贴壁细胞系可以用于研究胸膜间皮瘤的生物学特性、药物筛选和化疗药物敏感性等方面的研究。这种细胞系还可以用于评估治疗效果和开发新的治疗策略。

NCI-H2052人恶性胸膜间皮瘤贴壁细胞系

NCI-H2052人恶性胸膜间皮瘤贴壁细胞系细胞培养操作

1)复苏NCI-H2052人恶性胸膜间皮瘤贴壁细胞系细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)NCI-H2052人恶性胸膜间皮瘤贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)NCI-H2052人恶性胸膜间皮瘤贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

NCI-H2052人恶性胸膜间皮瘤贴壁细胞系可以用于ONYX-015与Nutlin-3a对恶性间皮瘤细胞的作用研究

通过ONYX-015与Nutlin-3a在间质瘤细胞中的作用效果,ONYX-015表达p53基因,Nutlin-3a减少p53降解,检测ONYX-015和Nutlin-3a的抗肿瘤效果,抑制细胞生长能力。结果显示,ONYX-015提高p53表达水平,促进p53磷酸化,同时,Nutlin-3a特异性的与恶性间皮瘤中MDM2蛋白的结合,蛋白酶体功能受到抑制,p53降解减少,导致p53蛋白堆积,同时p21表达升高并且磷酸化Rb的表达降低,细胞凋亡蛋白酶3(cleaved caspase-3)和细胞凋亡蛋白酶8(cleaved caspase-8)表达升高,激活p53介导的外源性凋亡信号传导通路。

方法:本实验使用体外培养恶性间皮瘤:MSTO-211H,NCI-H28,EHMES-10,NCI-H2052人恶性胸膜间皮瘤贴壁细胞系,EHMES-1,NCI-2452及JMN-1B细胞株。以MTT实验,通过MTT结果计算50%抑制药物浓度值(IC50),判断对数生长期细胞对选择性腺病毒(选用ONYX-015)及MDM2蛋白抑制剂(选用Nutlin-3a)在以上恶性间皮瘤细胞系的抑制敏感性。并使用Trypan blue dye exclusion assay检测ONYX-015对以上恶性间皮瘤细胞系的细胞生长的抑制效果。通过流式细胞技术检测细胞周期,分析ONYX-015对Sub-G1期为主的细胞周期的影响。使用Western blot方法分析ONYX-015及Nutlin-3a使用所导致细胞凋亡的传导通路变化。最后,运用细胞活性实验来检测,ONYX-015和Nutlin-3a联合用药相比于单独用药的药效区别,将产生协同作用还是拮抗作用。β-半乳糖苷酶转基因腺病毒(Ad/Lac Z)作为细胞毒性低的腺病毒,在实验过程中作为阴性对照。

结果:1 MTT的分析结果人体恶性间皮瘤细胞系:MSTO-211H,NCI-H28,EHMES-10,NCI-H2052,EHMES-1,NCI-2452及JMN-1B经过不同浓度的ONYX-015和处理对细胞活性的影响,Ad-Lac Z作为阴性对照。CI50结果显示MSTO-211H、NCI-H28、NCI-H2052人恶性胸膜间皮瘤贴壁细胞系、EHMES-10细胞较为敏感。同时结果提示MSTO-211H细胞对ONYX-015最为敏感,其次是NCI-H28、EHMES-10细胞对ONYX-015较为敏感。之后是NCI-H2052细胞,而EHMES-1,NCI-2452及JMN-1B细胞对ONYX-015不敏感。原因为EHMES-1,NCI-2452及JMN-1B为变异性p53细胞株,MSTO-211H、NCI-H28、NCI-H2052人恶性胸膜间皮瘤贴壁细胞系、EHMES-10为野生型p53细胞株。说明变异型p53细胞系普遍对ONYX-015不敏感。野生型p53细胞MSTO-211H、NCI-H28、NCI-H2052人恶性胸膜间皮瘤贴壁细胞系、EHMES-10经过Nutlin-3a处理,MSTO-211H、NCI-H28、EHMES-10细胞较为敏感,Nutlin-3a抑制了MSTO-211H、NCI-H28细胞的恶性间皮瘤细胞的生长。根据MTT计算的IC50结果提示NCI-H28细胞对Nutlin-3a最为敏感,其次是MSTO-211H细胞,之后是EHMES-10细胞,NCI-H2052细胞对Nutlin-3a敏感性不佳。

2台盼蓝染色检测(Trypan blue dye exclusion assay)Trypan blue dye exclusion assay结果显示:ONYX-015抑制了MSTO-211H、NCI-H28细胞的恶性间皮瘤细胞的生长。而Ad/Lac Z对照组生长情况与空白对照组类似,未受到明显抑制。

3流式细胞周期的分析结果分别使用ONYX-015和Ad/Lac Z感染恶性间皮瘤细胞NCI-H28和MSTO-211H,Ad/Lac Z作为阴性对照。ONYX-015导致NCI-H28细胞周期sub-G1期明显比例提升,以及细胞周期G2/M期比例提升,S期和G0/G1期比例减低。MSTO-211H细胞表现为Sub-G1比例,以及G0/G1期比例提升,G2/M期与S期比例变化幅度不明显。两种细胞对比,NCI-H28细胞与MSTO-211H细胞Sub-G1的比例相比,NCI-H28细胞的Sub-G1增加的更加明显,说明NCI-H28细胞对ONYX-015更加敏感性。同时,阴性对照Ad/Lac Z组的结果与空白对照组不存在明显差异。

参考文献

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