HT115细胞系|人结肠癌细胞的应用

背景^[1-3]

HT115细胞系|人结肠癌细胞是一种人结肠癌细胞系，通常用于研究人结肠癌的生物学特性和治疗策略。这种细胞系是通过将人结肠癌的肿瘤组织进行体外培养而获得的。

HT115细胞系|人结肠癌细胞具有一些独特的生物学特性，例如上皮细胞样形态、贴壁生长等。这种细胞系可以用于研究结肠癌的增殖、侵袭、转移等生物学行为，以及药物筛选和化疗药物敏感性等方面的研究。

HT115细胞系|人结肠癌细胞

HT115细胞系|人结肠癌细胞培养操作

1)复苏HT115细胞系|人结肠癌细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)HT115细胞系|人结肠癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)HT115细胞系|人结肠癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

HT115细胞系|人结肠癌细胞可以用于NDRG2调控结直肠癌细胞增殖的机制研究及其肠道特异性Ndrg2基因敲除小鼠的建立

Hepatocyte Growth Factor(HGF)是一个多功能的细胞生长因子,通过结合c-MET调控下游PI3K/Akt、MEK/ERK、JAK/STAT等信号通路,调节细胞增殖、分化、凋亡和迁移等生理过程,是组织器官发育的重要调控通路。c-MET的高表达或突变激活对于胶质瘤、乳腺癌、结肠癌、肝癌等恶性肿瘤的发生发展和转移都有重要的影响。HGF通过调控MEK/ERK和NF-κB等信号通路促进肺泡Ⅱ型细胞、黑色素瘤和胃癌等肿瘤细胞系的增殖,但在某些肿瘤细胞系(Hep G2、Huh7、HT29、HT115细胞系|人结肠癌细胞等)中,HGF则发挥增殖抑制的功能。这种差异可能与HGF/c-MET信号通路与其他信号通路的交联所导致的。转基因小鼠模型为基因的在体功能研究提供了很好的研究策略。

NDRG2对细胞增殖的调控作用已被多项实验所证实,通过Villi-Cre和Ndrg2-Loxp基因敲除系统构建了Ndrg2的肠上皮细胞特异性敲除小鼠,初步分析Ndrg2对小鼠的小肠和结肠发育的影响,并从动物实验的结果中分析NDRG2可能参与结肠癌发生和发展过程中的分子机制,为下一步研究打下基础。蛋白的翻译后修饰在蛋白功能发挥过程中发挥重要作用,特别是蛋白质的赖氨酸乙酰化修饰广泛参与了蛋白质的降解、转位和分泌等诸多生理过程。初步分析了NDRG2的蛋白质序列,结果显示有三个比较保守的赖氨酸位点。

分别针对这三个位点进行特异性组成型活化的突变(赖氨酸突变为谷氨酰胺)和组成型失活的突变(赖氨酸突变为精氨酸),研究NDRG2蛋白序列中这三个赖氨酸位点的功能。的研究表明,NDRG2过表达可以抑制结肠癌细胞的增殖。那么我们推测,在结肠癌细胞系HT29细胞、HT115细胞系|人结肠癌细胞中,NDRG2对细胞增殖的抑制依赖于HGF/c-MET信号通路。同时,我们发现肠道特异性的Ndrg2基因敲除小鼠的小肠和结肠有明显的表型变化,提示Ndrg2可能参与了小鼠肠道发育的调控过程。我们将在下一步工作中,致力于揭示NDRG2调控小鼠小肠和结肠发育过程的分子机制,进一步明确NDRG2的功能。

【目的】(1)阐明NDRG2调控HGF/c-MET信号通路抑制HT115细胞系|人结肠癌细胞增殖的分子机制。(2)构建Ndrg2肠上皮细胞基因特异敲除小鼠,并分析其表型变化。(3)初步明确NDRG2乙酰化修饰位点及其功能的影响。

【方法】(1)构建NDRG2过表达稳转HT115细胞系|人结肠癌细胞株,并以Real-time PCR和Western blot检测NDRG2对HGF、c-MET及其下游分子的影响。(2)构建Ndrg2肠上皮细胞基因特异敲除的转基因小鼠,通过Western blot和免疫组化验证NDRG2的敲除效果,并对基因特异敲除小鼠的表型做初步分析。(3)构建NDRG2特定赖氨酸位点突变的表达载体,明确对NDRG2的乙酰化修饰水平及其功能的影响。

【结果】(1)NDRG2通过调控HGF/c-MET信号通路,抑制HT29细胞、HT115细胞系|人结肠癌细胞的增殖。HGF激活c-MET和下游分子ERK1/2的磷酸化,上调下游分子p21和p27的表达,从而抑制HT29细胞的增殖。而在HT29细胞中过表达NDRG2可以上调HGF的表达和c-MET的磷酸化水平,并调控下游分子p21和p27的高表达,从而抑制细胞的增殖。

参考文献

[1]3,3′-Diindolylmethane rapidly and selectively inhibits hepatocyte growth factor/c-Met signaling in breast cancer cells.Holly L.Nicastro;;Gary L.Firestone;;Leonard F.Bjeldanes.The Journal of Nutritional Biochemistry,2013

[2]Pleiotropic effects of methionine adenosyltransferases deregulation as determinants of liver cancer progression and prognosis.Maddalena Frau;;Francesco Feo;;Rosa M.Pascale.Journal of Hepatology,2013

[3]Promoter methylation of AREG,HOXA11,hMLH1,NDRG2,NPTX2 and Tes genes in glioblastoma.Daina Skiriut?;;Paulina Vaitkien?;;Virginija A?monien?;;Giedrius Steponaitis;;Vytenis Pranas Deltuva;;Arimantas Tama?auskas.Journal of Neuro-Oncology,2013

[4]Loss of p53 in Enterocytes Generates an Inflammatory Microenvironment Enabling Invasion and Lymph Node Metastasis of Carcinogen-Induced Colorectal Tumors.Sarah Schwitalla;;Paul K.Ziegler;;David Horst;;Valentin Becker;;Irina Kerle;;Yvonne Begus-Nahrmann;;AndréLechel;;K.Lenhard Rudolph;;Rupert Langer;;Julia Slotta-Huspenina;;Franz G.Bader;;Olivia Prazeres da Costa;;Markus F.Neurath;;Alexander Meining;;Thomas Kirchner;;Florian R.Greten.Cancer Cell,2013

[5]马勇政.NDRG2调控结直肠癌细胞增殖的机制研究及其肠道特异性Ndrg2基因敲除小鼠的建立[D].第四军医大学,2016.