芋螺抗皱素的合成

介绍

芋螺抗皱素，英文名为mu‑conotoxin，具体肽序如下：H‑Pyr 1‑Gly 2‑Cys 3‑Cys 4‑Asn 5‑Gly 6‑Pro 7‑Lys 8‑Gly 9‑Cys 10‑Ser 11‑Ser12‑Lys 13‑Trp 14‑Cys 15‑Arg 16‑Asp 17‑His 18‑Ala 19‑Arg 20‑Cys 21‑Cys 22‑CONH2(Disulfide Bridge:3‑15,Disulfide Bridge:4‑21；Disulfide Bridge:10‑22)。芋螺抗皱素(mu‑conotoxin)属于u‑芋螺毒素家族，最早从海洋腹足类软体动物芋螺(Conidea)毒液中分离得到，靶向多种电压敏感性钠通道，主要阻断Nav1.4通道，选择性高、副作用小。

芋螺抗皱素主链氨基酸有22个，其肽链较长且有三对二硫键形成其特定的空间立体结构。一般为含有10‑30个氨基酸残基的小肽，绝大多数CTX分子内含有3对二硫键，是一类高度折叠的胜肽，穿透能力强，可以针对肌肉达到放松的作用。芋螺毒素肽按其二硫键的连接方式信号肽序列等结构特征研究发现，芋螺抗皱素可以通过抑制钠离子通道、钙离子通道以及乙酰胆碱受体，从而阻断神经信号传递抑制肌肉收缩，最终达到减少皱纹的效果。芋螺抗皱素可消除人面部上的表情皮肤皱纹，被用于化妆品领域[1]。

图一 芋螺抗皱素

合成

以往合成方法的缺点

芋螺抗皱素在生物体内含量极低，如果采用生物提取的技术获得，产量低、成本高，不适于产业化生产。随着多肽合成技术的发展与进步，现阶段已经可以通过化学合成的方法，产业化生产芋螺抗皱素。但在芋螺抗皱素实际的生产过程中，极容易生成二硫键错配的同分异构体，降低了粗肽的纯度，同时又会增加产品纯化的难度，造成生产收率低，成本高。

专利CN110698553 A提供了一种采用固相合成法制备芋螺抗皱素的方法，该方法按照芋螺抗皱素序列，将氨基酸从C端到N端依次偶联到树脂上，并切割下来得到线性肽，然后采用自然氧化法将线性肽氧化得到含3对二硫键的芋螺抗皱素粗肽环化液，粗肽环化液经纯化得到高纯度精肽。此方法线性肽在裂解过程中易被氧化，线性肽纯度较低。

专利CN112279905 A提供了一种芋螺抗皱素的制备方法，较专利CN110698553A，该方法在合成芋螺抗皱素肽链的过程中，灵活使用了二肽Fmoc‑Gly‑Pro‑OH和Fmoc‑Ser(t Bu)‑Ser(tBu)‑OH，能够有效减少线肽中缺失杂的生成；在线性肽氧化阶段，先选择性氧化形成1对二硫键，再通过自然氧化形成剩余2对二硫键，提高了芋螺抗皱素的收率。但该方法大量使用了高浓度巯基乙醇，环保压力较大。

专利CN113735955 B提供了一种芋螺抗皱素的制备方法，该方法在合成芋螺抗皱素肽链的过程中，同样使用了二肽Fmoc‑Gly‑Cys(tButhio)‑OH和Fmoc‑Asn(Trt)‑Gly‑OH，同时引入在TFA裂解条件下稳定的tButhio保护半胱氨酸巯基，有效提高了线性肽的纯化和终产品的收率。但是该方法中，大量使用了Fmoc‑Cys(t Buthio)‑OH，增加了生产成本。

因此，开发一种解决芋螺抗皱素产业化生产现存的上述问题，具有重要的意义。

新合成方法

（1）合成片段肽S1‑S5，Pyr‑Gly‑Cys(Mob)‑Cys(Trt)‑Asn(Trt)‑OH

第一个氨基酸的偶联：于500ml反应烧瓶中，加入27.8g CTC Resin(取代度1.08mmol/g，30mmol)、17.9g Fmoc‑Asn(Trt)‑OH(30mmol)和300mL二氯甲烷，搅拌至氨基酸完全溶解；搅拌条件下，向反应烧瓶中缓慢滴加入16mL DIPEA(90mmol，11.6g)。滴加完毕，水浴加热，定温T内＝30±3℃，反应5h。

肽树脂封端：量取30mL甲醇，搅拌条件下，缓慢加入到反应烧瓶中，反应温度T内＝30±3℃，反应0.5h。反应结束后，抽滤，肽树脂用300ml DMF洗涤4次，每次抽干，得到Fmoc‑Asn(Trt)‑CTC Resin。

（2）片段肽S1‑S5肽链延长反应

肽树脂N端氨基去保护：将肽树脂转移到合适的固相反应器中，向固相反应器中加入300ml去保护液1(20％ PIP，溶剂DMF)，打开N2阀门，开始反应，反应温度T内＝30±3℃，反应0.5h。反应结束后，抽滤，肽树脂用300mL DMF洗涤6次，每次抽干。取样做NT检测，检测结果为阳性。

偶联氨基酸：预活化：称取氨基酸(30mmol)和HOBt(30mmol)，加入到活化瓶中，并加入300ml DMF，搅拌溶清。冰水浴控温T内＝5±5℃，继续加入DIC(30mmol)，维持温度，活化5‑10min。偶联：活化完成后，将活化液加入到固相反应器中，打开N2阀门，开始反应，反应温度T内＝30±3℃。反应2h后开始取样进行NT检测，NT检测呈阴性后，停止反应，抽滤，肽树脂用300ml DMF洗涤4次，每次抽干。得到肽树脂Fmoc‑Asn(Trt)‑CTC Resin。

片段肽S1‑S5肽树脂延长反应得到：Pyr‑Gly‑Cys(Mob)‑Cys(Trt)‑Asn(Trt)‑CTC Resin。片段肽S1‑S5肽树脂收缩：肽树脂依次用300mL甲基叔丁基醚洗涤2次，每次抽干；用300mL二氯甲烷洗涤2次，每次抽干；再用300mL甲基叔丁基醚洗涤2次，每次抽干。得到肽树脂63.7g。

片段肽S1‑S5肽树脂裂解：于1000mL裂解瓶中，加入裂解液(20％TFE in DCM)，并缓慢加入肽树脂Pyr‑Gly‑Cys(Mob)‑Cys(Trt)‑Asn(Trt)‑CTC Resin，水浴加热，定温T内＝30±3℃，开始反应。裂解2‑3h后，停止反应，过滤，滤饼用二氯甲烷淋洗，收集全部滤液，30±3℃减压浓缩，浓缩残渣用甲基叔丁基醚打浆，过滤，淋洗，烘干，纯化，得到S1‑S5精品31.5g(28.3mmol)，总收率94.3％。

（3）芋螺抗皱素的合成

树脂溶胀：向固相反应器中，加入25.0g Rink Amide‑AM Resin(取代度：0.40mmol/g；10mmol)和250mL DMF，调节温度至T内＝30±3℃，溶胀1‑2h。溶胀结束后抽滤，并用250ml DMF洗涤2次，每次抽干。

（4）第一个氨基酸的偶联

树脂脱保护：向固相反应器中加入250mL去保护液1(20％ PIP/80％DMF)，打开N2阀门，调节温度至T内＝30±3℃，反应0.5h。反应结束后抽滤，并用250mL DMF洗涤6次，每次抽干；最后两次洗涤后，用广泛pH试纸检测滤液pH值，最后一次洗涤滤液pH＝7左右。取样进行NT检测，检测结果为阳性。

预活化：向活化瓶中加入12.4g Fmoc‑Cys(Acm)‑OH(30mmol)和4.1gHOBT(30mmol)，再加入250mL DMF搅拌溶清。控温至T内＝5±5℃，加入4.8mL DIC(3.8g，30mmol)，缓慢搅拌活化10±5min。

偶联：将上述活化液加入到固相反应器中，打开N2阀门，调节温度至T内＝30±3℃，开始反应。反应2h后开始取样进行NT检测，NT检测呈阴性后，停止反应，抽滤，肽树脂用250ml DMF洗涤4次，每次抽干。得到肽树脂Fmoc‑Cys(Acm)‑Rink Amide‑AM Resin。

（5）芋螺抗皱素肽链延长反应

肽树脂N端氨基去保护：向固相反应器中加入250ml去保护液1(20％PIP，溶剂DMF)，打开N2阀门，开始反应，反应温度T内＝30±3℃，反应0.5h。反应结束后抽滤，并用250mL DMF洗涤6次，每次抽干；最后两次洗涤后，用广泛pH试纸检测滤液pH值，最后一次洗

涤滤液p H＝7左右。取样进行NT检测，检测结果为阳性。

偶联氨基酸或肽段：预活化：称取氨基酸或肽段和HOBt，加入到活化瓶中，并加入N,N‑二甲基甲酰胺，搅拌溶清。冰水浴控温T内＝5±5℃，继续加入DIC，维持温度，活化5‑10min。偶联：活化完成后，将活化液加入到固相反应器中，打开N2阀门，开始反应。反应2h取样进行NT检测，NT检测呈阴性后，停止反应，抽滤，肽树脂用DMF洗涤4次，每次抽干，芋螺抗皱素的合成路线图如图二所示。

图二 芋螺抗皱素的合成路线

芋螺抗皱素肽链延长反应，合成得到Pyr1‑Gly2‑Cys3(Mob)‑Cys4(Trt)‑Asn5(Trt)‑Gly6‑Pro7‑Lys8(Boc)‑Gly9‑Cys10(Acm)‑Ser11(t Bu)‑Ser12(tBu)‑Lys13(Boc)‑Trp14(Boc)‑Cys15(Mob)‑Arg16(Pbf)‑Asp17(OtBu)‑His18(Trt)‑Ala19‑Arg20(Pbf)‑Cys21(Trt)‑Cys22 (Acm)‑Rink Amide‑AM Resin。

参考文献

[1]应连心. 芋螺抗皱素的制备方法[P]. 浙江省：CN110698553B,2023-05-16.

[2]魏席,邓德雄,李原强等. 一种芋螺抗皱素的固相合成方法[P]. 江苏省：CN116813740A,2023-09-29.