小鼠T淋巴细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠T淋巴细胞属于获得性免疫系统，在执行和控制体液和细胞介导的免疫反应中起着不可或缺的作用。它与其他淋巴细胞（B细胞和NK细胞）的区别在于其细胞表面的T细胞受体（TCR）的表达。T淋巴细胞来源于骨髓前体细胞（TCP），在胸腺中，该前体通过四个阶段分化，所有阶段的特征都是CD4-CD8-表型，即所谓的双阴性（DN）细胞。

根据CD44、CD25和CD117的差异表达可区分DN不同分化阶段(DN1-DN4)。DN3表达preTCR，进入DN4期，然后是CD8(ISP：中间单阳性)的表达，紧接着是CD4的表达，从而进展到CD4+CD8+双阳性(DP)期。最后，阳性选择最后会生成CD4或CD8单阳性T细胞。成熟的CD4和CD8单阳性细胞离开胸腺，通过外周循环到达次级淋巴器官，成为初始T细胞，每个细胞都有独特的抗原特异性。

小鼠T淋巴细胞

小鼠T淋巴细胞培养操作

1)复苏小鼠T淋巴细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)小鼠T淋巴细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)小鼠T淋巴细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

小鼠T淋巴细胞可以用于白芍总苷对小鼠T淋巴细胞体外增殖及活化诱导细胞死亡的影响

研究白芍总苷(total glucosides of paeony,TGP)对小鼠T淋巴细胞体外增殖及活化诱导细胞死亡(AICD)的影响,并初探其免疫抑制机制。

方法:1.富集小鼠脾脏T淋巴细胞:利用免疫磁珠分选技术,无菌分离C57BL/6小鼠脾脏T淋巴细胞,流式细胞仪检测T淋巴细胞纯度。

2.TGP对活化诱导小鼠T淋巴细胞死亡(AICD)的影响:将纯化后的T淋巴细胞悬液接种到24孔板中,7.5×l05个/孔,按照TGP溶液终浓度(0ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml)设为空白组、TGP低中高剂量组,anti-CD3/CD28刺激T淋巴细胞活化,培养24h或48h后采用AnnexinV/7AAD染色检测细胞活性。

3.TGP对小鼠T淋巴细胞增殖的影响:利用CFSE标记T淋巴细胞,然后将CFSE标记的T淋巴细胞接种到24孔板中,7.5×105个/孔,按照TGP溶液终浓度(0ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200 ug/ml)设为空白组、TGP低中高剂量组,anti-CD3/CD28刺激T淋巴细胞增殖,培养48h后,收集细胞进行流式检测,计算活细胞分裂代数和比例。

4.TGP对活化小鼠T淋巴细胞Fas或FasLmRNA表达的影响:纯化的CD4+T淋巴细胞接种于24孔板中,7.5×1 05个/孔,设空白组和中浓度组(100ug/ml),anti-CD3/CD28刺激T淋巴细胞活化,24小时后收集细胞,提取总RNA并逆转录为cDNA,RT-PCR检测Fas或FasL mRNA相对表达量。

5.TGP对活化小鼠T淋巴细胞表面Fas或FasL蛋白表达的影响将纯化后的T淋巴细胞悬液接种到24孔板中,7.5×105个/孔,按照TGP溶液终浓度(0ug/ml、100 ug/ml、200 ug/ml)设为空白组、TGP中、高剂量组,anti-CD3/CD28刺激T淋巴细胞活化,培养24h后,收集细胞,染色后流式检测T淋巴细胞表面Fas或FasL表达量。

6.TGP对小鼠T淋巴细胞凋亡相关蛋白Bcl-2表达的影响CD4+T淋巴细胞接种于24孔板中,7.5×105个/孔,设空白组和中、高浓度组(100ug/ml、200ug/ml),anti-CD3/CD28刺激T淋巴细胞活化,24小时后收集细胞,Western Blot检测Bcl-2蛋白的表达。

结果:1.TGP可显著促进小鼠T淋巴细胞胞AICD作用流式结果显示:TGP处理24小时后,与空白组相比,高剂量组活细胞比例显著降低;而TGP处理48小时后,中、高剂量组活细胞比例均较空白组显著降低。

2.TGP可显著抑制小鼠T淋巴细胞增殖流式结果显示:TGP处理48小时后,与空白组相比,TGP低中高剂量处理组细胞分裂代数和分裂细胞比例显著降低,且该作用具有药物浓度依赖性,高浓度时细胞增殖可被完全抑制。

3.TGP可通过增加Fas的表达促进小鼠T淋巴细胞AICDRT-PCR结果提示:中剂量TGP处理CD4+T淋巴细胞后,Fas mRNA表达量明显升高。流式结果提示:TGP中、高剂量处理组活化T淋巴细胞表面Fas表达量较空白组显著增加。

参考文献

[1]Neuroprotection by Paeoniflorin against Nuclear Factor Kappa B-Induced Neuroinflammation on Spinal Cord Injury.Bin Wang;;Wangying Dai;;Lijun Shi;;Honglin Teng;;Xigong Li;;Jing Wang;;Wujun Geng;;Alfredo Conti.BioMed Research International,2018

[2]Side effects of methotrexate therapy for rheumatoid arthritis:A systematic review.Wanying Wang;;Hua Zhou;;Liang Liu.European Journal of Medicinal Chemistry,2018

[3]Paeoniflorin inhibits activation of the IRAK1-NF-κB signaling pathway in peritoneal macrophages from lupus-prone MRL/lpr mice.Lina Ji;;Xiaoli Hou;;Wenhong Liu;;Xian Deng;;Ziyan Jiang;;Kaichen Huang;;Rongqun Li.Microbial Pathogenesis,2018

[4]Total glucosides of paeony ameliorates TNBS?induced colitis by modulatingdifferentiation of Th17/Treg cells and the secretion of cytokines.Haihua Lin;;Wenyou Zhang;;Xuepei Jiang;;Renpin Chen;;Xielin Huang;;Zhiming Huang.Molecular Medicine Reports,2017

[5]熊传锋.白芍总苷对小鼠T淋巴细胞体外增殖及活化诱导细胞死亡的影响[D].南方医科大学,2019.