猫衣原体PCR试剂盒的应用

背景^[1-3]

猫衣原体PCR试剂盒是一种用于检测猫衣原体的生物试剂盒。这种试剂盒使用PCR技术，通过特异性引物扩增猫衣原体DNA片段，从而实现对猫衣原体的检测。

猫衣原体PCR试剂盒具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点，适用于对感染疾病的诊断。只要样本有一个病原体存在，PCR就可以检测到。试剂盒的引物经过精心优化，专一性强，只扩增猫衣原体，与其他微生物没有交叉反应。

猫衣原体PCR试剂盒是一种用于检测猫衣原体的PCR试剂盒。猫衣原体是一种细菌，可以感染猫和其他动物，引起呼吸道、泌尿生殖道等疾病。

猫衣原体PCR试剂盒包含PCR反应体系、引物、荧光探针等成分，可以扩增出猫衣原体的DNA片段，并通过荧光信号检测来确定是否存在猫衣原体感染。

猫衣原体PCR试剂盒

猫衣原体(Chlamydia felis,C.felis)是猫衣原体病的病原体。与猫疱疹病毒-I型(Feline Herpeto Virus-1,FHV-1)、猫杯状病毒(Feline Calici Virus,FCV)同是引起猫上呼吸道疾病(FURTD)的主要病原。轻者引起猫结膜炎、鼻炎及咽炎,严重者表现为肺炎、关节炎和跛行等。临床病例中,感染猫衣原体的人和动物通过抗菌治疗治愈(如两性霉素),但易复发。由于猫衣原体感染的群体广泛性以及反复性,预防人和动物感染猫衣原体疾病、控制猫衣原体传播的最佳途径是研究安全有效的疫苗。

猫衣原体PCR试剂盒的使用步骤一般包括以下几步：

1.样本采集：从猫的眼部分泌物、鼻部分泌物等部位采集样本。

2.样本处理：将采集的样本进行处理，提取出其中的DNA。

3.配置反应体系：根据试剂盒说明书中的指示，配置PCR反应体系，包括PCR反应液、引物、DNA模板等。

4.设定PCR程序：根据试剂盒说明书中的指示，设定PCR程序，包括变性、退火、延伸等温度和时间。

5.运行PCR程序：将配置好的PCR反应体系放入PCR仪中，运行设定的PCR程序。

6.结果分析：在PCR程序运行结束后，对扩增产物进行电泳或其他方法检测，以判断是否扩增出特定基因片段，从而实现对猫衣原体的检测。

应用^[4-5]

猫衣原体PCR试剂盒可以用于表达猫衣原体momp蛋白的重组病毒构建及免疫原性研究

采用狂犬病病毒SRV9株反向遗传载体、杆状病毒表达载体构建表达momp的重组病毒,通过血清学实验,进行免疫原性评价。重组狂犬病病毒(SRV9-MOMP)的拯救:基于RABV SRV9株反向遗传操作系统,在其P与M基因间隔区插入猫衣原体的主要外膜蛋白基因(MOMP),构建含有MOMP结构的重组质粒pUC57-SRV9-MOMP(P/M)。经猫衣原体PCR试剂盒的PCR鉴定、基因测序,正确的重组狂犬病病毒感染性全基因组质粒pUC57-SRV9-MOMP(P/M)与其辅助质粒共同转染至BSR-T7细胞拯救重组狂犬病病毒SRV9-MOMP。从基因组和蛋白两个方面鉴定外源基因的插入及表达情况,研究重组毒的生长动力学、遗传稳定性和致病性等特性。

免疫荧光观察结果表明重组狂犬病病毒拯救成功;猫衣原体PCR试剂盒的RT-PCR结果显示,MOMP基因已成功插入重组病毒基因组中,并在传代过程中遗传稳定;Western Blot分析证明猫衣原体momp在SRV9-MOMP中成功表达;生长动力学曲线表明重组病毒与母本病毒在BSR-T7细胞上的增值水平无显著差异,SRV9-MOMP病毒滴度可达到1×108.125TCID50/mL;乳鼠颅内攻毒实验表明,与母本病毒相比,重组病毒的致病性降低。此部分实验构建了插入猫衣原体MOMP基因的重组狂犬病病毒感染性全基因组质粒pUC57-SRV9-MOMP(P/M),拯救了SRV9-MOMP重组病毒,病毒滴度高、外源蛋白momp遗传稳定、该重组病毒可作为疫苗候选用于进一步的免疫研究。

重组杆状病毒(Ac-MOMP)构建:基于杆状病毒表达载体,将猫衣原体MOMP基因克隆至pFastBacI载体的多克隆位点,获得重组质粒pFastBacI-MOMP(pF-MOMP)。经猫衣原体PCR试剂盒PCR鉴定正确的重组质粒转化到DH10Bac大肠杆菌感受态中,经蓝白斑筛选后,将鉴定正确的重组杆粒Bacmid-MOMP(Bac-MOMP)转染Sf9细胞,拯救表达momp的重组杆状病毒AcMNPV-MOMP(Ac-MOMP)。细胞形态观察、荧光观察表明重组杆状病毒拯救成功;Western Blot分析,momp可在重组杆状病毒Ac-MOMP中稳定遗传。该重组病毒安全性好、易于大量制备,可作为疫苗候选用于进一步的免疫研究。

为了探究重组病毒SRV9-MOMP和Ac-MOMP灭活后的免疫保护效力:将重组病毒SRV9-MOMP和Ac-MOMP灭活后按照最高剂量相同体积分别对猫进行免疫,通过肌肉注射免疫2次,相隔14 d。首免后2周、4周、6周、8周采集血清。最后,采用猫衣原体进行攻毒试验。采用中和试验检测重组病毒SRV9-MOMP和Ac-MOMP灭活后免疫猫刺激机体产生的抗momp中和抗体水平,评价灭活病毒的免疫保护效力;采用FAVN检测灭活病毒SRV9-MOMP免疫的猫体内抗RABV中和抗体水平。中和试验结果显示经灭活病毒SRV9-MOMP和Ac-MOMP免疫猫的血清中含有高效抗momp中和抗体,能够保护机体免受猫衣原体的感染。FAVN试验表明,灭活病毒SRV9-MOMP免疫的猫血清含有高滴度的抗RABV中和抗体。

参考文献

[1]Genomic evidence that the live Chlamydia abortus vaccine strain 1B is not attenuated and has the potential to cause disease.David Longbottom;;Michelle Sait;;Morag Livingstone;;Karine Laroucau;;Konrad Sachse;;Simon R.Harris;;Nicholas R.Thomson;;Helena M.B.Seth-Smith.Vaccine,2018

[2]Mechanisms of the Innate Defense Regulator Peptide-1002 Anti-Inflammatory Activity in a Sterile Inflammation Mouse Model.Bing Catherine Wu;;Amy Huei-Yi Lee;;Robert E.W.Hancock.The Journal of Immunology,2017

[3]Transcutaneous immunization with a novel imiquimod nanoemulsion induces superior T cell responses and virus protection.Pamela Aranda Lopez;;Mark Denny;;Ann-Kathrin Hartmann;;Astrid Alflen;;Hans Christian Probst;;Esther von Stebut;;Stefan Tenzer;;Hansjörg Schild;;Michael Stassen;;Peter Langguth;;Markus P.Radsak.Journal of Dermatological Science,2017

[4]One-Health:a Safe,Efficient,Dual-Use Vaccine for Humans and Animals against Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus and Rabies Virus.Christoph Wirblich;;Christopher M.Coleman;;Drishya Kurup;;Tara S.Abraham;;John G.Bernbaum;;Peter B.Jahrling;;Lisa E.Hensley;;Reed F.Johnson;;Matthew B.Frieman;;Matthias J.Schnell.Journal of Virology,2017

[5]阮晓凤.表达猫衣原体momp蛋白的重组病毒构建及免疫原性研究[D].吉林农业大学,2020.