兔冠状动脉平滑肌细胞的应用

背景^[1-3]

兔冠状动脉平滑肌细胞是一种实验细胞系，通常用于研究心血管系统的生物学和药理学。这种细胞系具有收缩和舒张血管的功能，是心血管系统中的重要组成部分。

兔冠状动脉平滑肌细胞可以用于研究心血管疾病的发生和发展机制，以及药物对心血管系统的调节作用。这种细胞系还可以用于研究平滑肌细胞的生理和药理特性，以及平滑肌细胞与其他类型细胞之间的相互作用。

兔冠状动脉平滑肌细胞

兔冠状动脉平滑肌细胞培养操作

1)复苏兔冠状动脉平滑肌细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)兔冠状动脉平滑肌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)兔冠状动脉平滑肌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

兔冠状动脉平滑肌细胞可以用于用二仙含药血清通过雌激素受体抑制Ox-LDL诱导的冠状动脉平滑肌细胞增殖

在细胞水平探究二仙含药血清对氧化型低密度脂蛋白诱导的冠状动脉平滑肌细胞增殖的影响,并探讨其机制。

方法:1.细胞培养:应用兔冠状动脉平滑肌细胞,置于完全培养基中培养,实验细胞为第4-6代细胞(均处于对数生长期)。

2. 实验步骤:首先给予不同浓度Ox-LDL进行诱导兔冠状动脉平滑肌细胞,并行CCK-8筛选出最佳浓度为50mg/L Ox-LD;并筛选出10%二仙含药血清为最佳浓度;正式实验分组为9组:正常细胞组、模型组(Ox-LDL)、阳性对照组(17-β雌二醇)、阴性对照组(大鼠阴性血清)、二仙含药血清组、ICI182780组、G15组、二仙含药血清+ICI182780组、二仙含药血清+G15组,倒置显微镜下观察细胞形态,CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞术(Flou-3)测定钙离子浓度,荧光定量PCR检测细胞中GPER30、ERK1/2、AKT m RNA表达,ELISA、Western blot法测定GPER30、ERK1/2、AKT蛋白表达。

结果:1.倒置显微镜观察二仙含药血清对Ox-LDL诱导的兔冠状动脉平滑肌细胞形态学影响与正常RCSMCs比较,在Ox-LDL的作用下RCSMCs细胞胞体增大,由梭形变为不规则形,而二仙含药血清干预后细胞胞体变小,加入ICI182780及G15后二仙含药血清这一作用减弱。

3. CCK-8法检测二仙含药血清对Ox-LDL诱导的兔冠状动脉平滑肌细胞增殖活性的影响与正常细胞比较,Ox-LDL明显促进细胞增殖,而二仙含药血清干预后抑制了Ox-LDL对细胞的促进作用,并且二仙含药血清的这一作用可以被ICI182780及G15阻断。

4. 流式细胞术检测二仙含药血清对Ox-LDL诱导的兔冠状动脉平滑肌细胞中钙离子水平的影响与模型组比较,二仙含药血清组明显降低了RCSMCs钙离子浓度;与二仙含药血清组比较,二仙含药血清+ICI182780组及二仙含药血清+G15组均阻断了二仙含药血清对平滑肌增殖的抑制作用。

5. 荧光PCR法检测二仙含药血清对Ox-LDL诱导的兔冠状动脉平滑肌细胞GPER30、ERK1/2、AKT m RNA表达水平的影响与模型组比较,二仙含药血清组GPER30 m RNA表达明显升高,而对ERK1/2、AKT m RNA表达无明显影响;与二仙含药血清组比较,二仙含药血清+ICI182780组、二仙含药血清+G15组GPER30 m RNA表达明显减少,而ERK1/2、AKT m RNA表达分别未见明显变化;说明在基因水平上二仙含药血清促进了GPER30基因表达而对ERK1/2、AKT无明显作用,且二仙含药血清的这一作用可以被ICI182780及G15阻断。

6. ELISA法检测二仙含药血清对Ox-LDL诱导的兔冠状动脉平滑肌细胞GPER30、ERK1/2、AKT等蛋白表达的影响与模型组比较,二仙含药血清组GPER30蛋白表达水平明显升高,而ERK1/2、AKT蛋白表达水平明显降低;与二仙含药血清组比较,二仙含药血清+ICI182780组、二仙含药血清+G15组GPER30蛋白表达水平均明显下降,而ERK1/2、AKT蛋白表达水平均明显升高;说明在蛋白水平上二仙含药血清明显促进了GPER30蛋白表达而抑制ERK1/2、AKT蛋白表达,且二仙的这一作用可以被ICI182780及G15阻断。

参考文献

[1]Pharmacological effects of icariin..He Chunyang;;Wang Ze;;Shi Jingshan.Advances in pharmacology(San Diego,Calif.),2020

[2]Icariin and its metabolites regulate lipid metabolism:From effects to molecular mechanisms.Miao Wang;;Hongyan Gao;;Weihong Li;;Bin Wu.Biomedicine&Pharmacotherapy,2020

[3]Formononetin attenuates atherosclerosis via regulating interaction between KLF4 and SRA in apoE-/-mice..Ma Chuanrui;;Xia Ronglin;;Yang Shu;;Liu Lipei;;Zhang Jing;;Feng Ke;;Shang Yuna;;Qu Jingtian;;Li Lingwei;;Chen Ning;;Xu Shixin;;Zhang Wenwen;;Mao Jingyuan;;Han Jihong;;Chen Yuanli;;Yang Xiaoxiao;;Duan Yajun;;Fan Guanwei.Theranostics,2020

[4]Icariin modulates carrageenan-induced acute inflammation through HO-1/Nrf2 and NF-kB signaling pathways.Nagla A.El-Shitany;;Basma G.Eid.Biomedicine&Pharmacotherapy,2019

[5]刘会会.二仙含药血清通过雌激素受体抑制Ox-LDL诱导的冠状动脉平滑肌细胞增殖[D].延安大学,2021.