GST pulldown试剂盒

背景^[1-8]

GST pulldown试剂盒是利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。

GST-pulldown主要包括以下三个部分：①利用基因重组技术构建带有GST标签的原核表达载体；②通过原核表达系统表达带有GST标签的融合蛋白；③利用GST亲和纯化柱进行蛋白纯化获得高纯度的融合蛋白，再利用GST亲和纯化柱进行蛋白间的相互作用检测。

基本原理是将靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。

实验注意内源性蛋白的干扰使得实验出现的假阳性结果较多：

1. 高纯度的GST融合蛋白能够减少实验的假阳性。由于高纯度的融合蛋白能减少实验结果的假阳性，因此获得高纯度的融合蛋白对于GST-pull down实验结果分析具有重要的作用。同时，为了能够程度的保证融合蛋白原有的生物学活性，一般在获取融合蛋白时倾向于可溶性融合蛋白，因此获得高纯度的可溶性蛋白很关键。对于可溶性蛋白的获得条件主要有①载体的选择。②可溶性蛋白表达条件的选择，③诱导温度，④诱导时间，⑤诱导物的浓度，能够不被细胞代谢而且具有稳定的浓度。

2. GST标签虽然不会对下游蛋白的折叠和功能造成影响，促进重组蛋白的可溶性表达，但是GST标签可能会影响蛋白的正确折叠，因此对融合蛋白进行质量控制，会使实验结果更加可靠。

3. 在实验中，有时会加入核酸酶来消除可能桥接到蛋白上的DNA和RNA，也有可能会导致蛋白间的相互作用。

应用^[9][10]

GST pulldown试剂盒可用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白：

例如在青岛文昌鱼（Branchiostoma belcheri tsingtaunese）GST和FREP基因的表达与功能研究中青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtaunese)肠cDNA文库中,分离了具有完整编码框的,与脊椎动物肝脏功能密切相关的谷胱苷肽转硫酶(GST)和纤维蛋白原相关蛋白(FREP)基因,并对它们的结构、进化、表达和功能进行了研究。

参考文献

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