地高辛(DIG)原位杂交试剂盒

背景^[1-6]

地高辛(DIG)原位杂交试剂盒是一款利用非放射标记物地高辛(DIG)的原位杂交试剂盒。地高辛标记技术源于一种从洋地黄类植物（毛地黄和毛花毛地黄）中提取的类固醇物质——Digoxigenin（DIG）。由于洋地黄植物的花和叶片Digoxigenin在自然界中的唯一来源，因此抗DIG的抗体不会与其他的生物物质结合，从而可以满足特异性标记的需要。

这一点，正是DIG胜于生物素(Biotin)的地方——同样是小分子标记物，生物素广泛存在于各种组织中，对于灵敏度很高的标记检测实验来说，样品自身含有的内源生物素，就会对结果产生干扰。地高辛就能够很好地避免这个问题。

DIG通过一个含有11个碳原子的空间臂与尿嘧啶核苷酸上的C5位置相连，一定浓度的DIG标记的核苷酸可以通过DNA polymerase(如E.coli DNA Polymerase,T4 DNA Polymerase,T7 DNA Polymerase,Reverse Transcriptase,Taq DNA Polymerase）、RNA polymerase(如SP6,T3或T7 RNA Polymerase)或是末端转移酶（Terminal Transferase）的作用掺入到核苷酸探针中；也可通过随即引物标记（random primed labeling）,缺口平移（nick translation），PCR，3’端标记/加尾或是体外转录制备带有DIG标记的探针。当然也可以通过化学合成的方法进行核苷酸的标记。

对于DIG标记探针的杂交检测，可选用连接有碱性磷酸酶（alkaline phosphatase），过氧化物酶(peroxidase),荧光素（fluorescein）,若丹明（rhodamine）或是胶体金（colloidal gold）高亲和性的抗DIG抗体共轭物；也可选用不带任何共轭连接的抗DIG抗体和二级抗体。

检测的灵敏度主要依赖于对不同抗DIG抗体共轭物显示方法的选择。以连接有碱性磷酸酶的抗DIG抗体为例：即可以使用NBT或BCIP做底物的显色法，也可以使用HNPP荧光碱性磷酸酶底物，检测的灵敏度常规可达到0.1pg(Souther blot)。所谓DNA探针，实质上是一段已知的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂交。

如果靶基因和探针的核苷酸序列相同，就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交，从而达到检查样品基因的目的。在随机引物法标记反应液中，有随机合成的六聚体核昔酸(hexanucleotide)作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成掺入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应来进行检测。一般通过酶标抗地高辛抗体来检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检测一般用碱性磷酸酶系统，BC1P/NBT显色。敏感性很高。可用于膜上杂交和原位杂交。

地高辛(DIG)原位杂交试剂盒特点：

（1）标记属高效标记反应。以1μgDNA探针为例，1小时反应即可产生0.8μg标记探针，20小时可产生2μg左右的标记探针。

（2）试剂将标记反应所需的引物、核苷酸、DIG-11dUTP和Klenow酶等混合在一起。一次标记只需吸取一次标记液，使用至为简便。

（3）标记反应适于下述对象：a.DNA从10ng—3μg。b.不等的DNA长度100bp—10kb。c.线形排列或呈高度卷曲之DNA。d.低融点琼脂中的DNA。

（4）检测系统抗体为抗地高辛单抗，标记碱性磷酸酶。效价1：5000（膜上杂交）或1：500（原位杂交）。

（5）显色剂为BCIP/NBT，两种成分混合后保存于67%DMF中，非常稳定。用时1：50稀释。

（6）试剂盒敏感性达到0.1pg，足够检测出1μg基因组DNA中的单个基因。

（7）除用于各种膜上杂交之外，还可用于原位杂交(ISH)。

应用^[7]

地高辛(DIG)原位杂交试剂盒可用于DNA 探针的随机引物标记及各种膜上杂交和原位杂交。

例如在地高辛标记探针原位杂交检测猪延髓TPH2 mRNA的表达的研究中采用PCR法对猪TPH2 cDNA探针进行地高辛(digoxigenin,DIG)标记,应用核酸分子原位杂交技术检测猪延髓组织内TPH2 mRNA的表达。结果表明:地高辛标记的TPH2cDNA探针使用简便,灵敏度高,特异性强,杂交结果直观,探针保存时间较长,无放射性污染;猪延髓组织内的血管壁、蛛网膜、下橄榄核区与极后区的神经元均有阳性反应,TPH2 mRNA的表达较高,提示了TPH2在这些部位的存在与5-HT的转运具有相关性。

参考文献

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[5]Glucocorticoid status affects antidepressant regulation of locus coeruleus tyrosine hydroxylase and dorsal raphe tryptophan hydroxylase gene expression.Heydendael W,,Jacobson L.Brain Research.2009

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