PT-K75猪鼻甲黏膜成纤维贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

PT-K75猪鼻甲黏膜成纤维贴壁细胞系是一种来源于猪鼻甲黏膜的细胞系。猪鼻甲黏膜是一种富含成纤维细胞的组织，这些细胞在生物医学研究中具有广泛的应用价值，如组织工程、药物筛选等。

PT-K75猪鼻甲黏膜成纤维贴壁细胞系具有以下特点：

形态特征：细胞呈长条形或多角形，具有多个突起，核较大，核质比高。

生长特性：细胞生长迅速，分裂能力强，可以在体外持续传代。

成纤维细胞特性：PT-K75猪鼻甲黏膜成纤维贴壁细胞系主要由成纤维细胞组成，这些细胞具有较强的增殖能力和分泌胶原蛋白的能力。

药物敏感性：PT-K75猪鼻甲黏膜成纤维贴壁细胞系对多种抗癌药物具有敏感性，因此常被用于药物筛选和药效评价。

通过研究PT-K75猪鼻甲黏膜成纤维贴壁细胞系，可以深入了解猪鼻甲黏膜成纤维细胞的生物学特性，为生物医学研究提供实验基础。此外，由于猪鼻甲黏膜与人类鼻黏膜具有相似的结构和功能，因此PT-K75猪鼻甲黏膜成纤维贴壁细胞系也为研究人类鼻黏膜相关疾病提供了有价值的模型。

PT-K75猪鼻甲黏膜成纤维贴壁细胞系

PT-K75猪鼻甲黏膜成纤维贴壁细胞系细胞培养操作

1)复苏PT-K75猪鼻甲黏膜成纤维贴壁细胞系细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)PT-K75猪鼻甲黏膜成纤维贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)PT-K75猪鼻甲黏膜成纤维贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

PT-K75猪鼻甲黏膜成纤维贴壁细胞系可以用于猪巨细胞病毒基因组分子特征分析及其复制非必需基因的鉴定

应用PCR技术对临床收集的猪肺脏组织进行了PCMV检测,利用表达的PCMV糖蛋白B(glycoprotein B,gB)建立了ELISA方法,并对收集的猪场血清样本进行了PCMV抗体检测,了解我国猪群的PCMV感染状况；对PCMV分离毒株进行了全基因组序列测定,分析了病毒的基因组分子特征,以期为PCMV的分类提供科学依据；同时对PCMV的复制非必需基因进行了筛选和鉴定,为深入研究PCMV基因功能及分子病原学相关研究奠定基础。

采用PCR技术,对2006-2010年收集自我国14个地区49个规模化猪场的812份肺组织病料进行了PCMV检测。结果表明,共检出317份阳性样本,PCMV阳性率为39.04%；猪场阳性率为97.96%。对随机选取的142份阳性扩增产物进行了测序,并与国外参考毒株序列进行比对。结果表明,扩增产物的核苷酸序列同源性为97.6%-100%,推导的氨基酸序列同源性为95.6%-100%。遗传演化分析显示,我国PCMV主要分属于亚群2和亚群3。上述结果表明,在我国猪群中PCMV感染较为广泛,病毒的DPOL基因存在一定程度的变异。

利用原核表达系统对PCMV gB基因进行了表达,并用纯化的表达蛋白作为包被抗原建立了检测PCMV抗体的间接ELISA。应用ELISA对2009-2011年收集自14个地区27个猪场的1234份血清样本进行了PCMV抗体检测。

结果显示,样本的PCMV抗体总阳性率为84.28%；猪场阳性率为100%；猪群抗体阳性率随日龄的增长呈逐渐上升趋势,母猪群的PCMV阳性率高达99.46%。血清学检测结果提示,我国猪群中PCMV的感染十分普遍。将PCR检测为PCMV阳性的猪肺泡巨噬细胞(Pulmonary alveolar macrophages,PAMs)与PT-K75猪鼻甲黏膜成纤维贴壁细胞系细胞共培养,成功分离到1株PCMV,命名为BJ09。在PT-K75猪鼻甲黏膜成纤维贴壁细胞系细胞上,该毒株感染可偶见合胞体和巨细胞病变。经透射电镜可见典型的PCMV粒子。用PT-K75猪鼻甲黏膜成纤维贴壁细胞系细胞培养PCMV BJ09,提取病毒基因组DNA,用高通量测序方法对BJ09毒株全基因组序列进行了测定,并分析了该毒株的基因组特征。

结果表明,PCMV BJ09的基因组全长为128367bp,预测的编码基因有79个；其中,69个基因与HHV-6A、HHV-6B和HHV-7具有同源性,2个基因与其它β疱疹病毒有同源性,而其余8个基因为PCMV特有；PCMV与HHV-6A、HHV-6B和HHV-7同源基因的氨基酸同源性相对较高,且基因方向和位置均一致；PCMV基因组结构为DR-U-DR形式,与HHV-6A、HHV-6B和HHV-7相同；对PCMV核心基因的演化分析表明,PCMV与HHV-6A、HHV-6B和HHV-7处于同一分支。

参考文献

[1]Comparative Analysis of gO Isoforms Reveals that Strains of Human Cytomegalovirus Differ in the Ratio of gH/gL/gO and gH/gL/UL128-131 in the Virion Envelope.Momei Zhou;;Qin Yu;;Anya Wechsler;;Brent J.Ryckman.Journal of Virology,2013

[2]A Myeloid Progenitor Cell Line Capable of Supporting Human Cytomegalovirus Latency and Reactivation,Resulting in Infectious Progeny.Christine M.O'Connor;;Eain A.Murphy.Journal of Virology,2012

[3]Interaction between the Human Cytomegalovirus Tegument Proteins UL94 and UL99 Is Essential for Virus Replication.Stacia L.Phillips;;Daniel Cygnar;;Alexandra Thomas;;Wade A.Bresnahan.Journal of Virology,2012

[4]Tale of a tegument transactivator:the past,present and future of human CMV pp71.Penkert,Rhiannon R;;Kalejta,Robert F.EN,2012

[5]顾伟伟.猪巨细胞病毒基因组分子特征分析及其复制非必需基因的鉴定[D].中国农业大学,2014.