RD 人恶性胚胎横纹肌瘤细胞系的应用

背景^[1-3]

RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞系是一种来源于人类恶性胚胎横纹肌瘤(RD)的细胞系。RD是一种罕见的恶性肿瘤，起源于胚胎期的横纹肌组织，通常发生在儿童和青少年。RD细胞系的建立有助于研究RD的生物学特性、发病机制以及潜在的治疗方法。

RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞系具有以下特点：

形态特征：RD细胞呈长条形或多角形，具有多个突起，核较大，核质比高。

生长特性：RD细胞生长迅速，分裂能力强，可以在体外持续传代。

黑色素生成能力：RD细胞具有黑色素生成能力，因此常用于研究黑色素瘤的发生、发展和治疗。

药物敏感性：RD细胞对多种抗癌药物具有敏感性，因此常被用于药物筛选和药效评价。

基因表达特征：RD细胞具有一些与恶性胚胎横纹肌瘤相关的基因表达特征，如MYCN、CDK4等基因的高表达。

RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞系

RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞系细胞培养操作

1)复苏RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞系细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞系可以用于组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA抑制RD细胞增殖和诱导其凋亡的实验研究

研究SAHA对RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞系细胞增殖、细胞周期、凋亡、自噬和迁移能力的影响,并探索其诱导凋亡的机制。

方法:不同浓度SAHA作用于RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞系细胞,MTT法检测对细胞增殖作用的影响,western blot检测ERK信号通路蛋白表达;PI染色法分析细胞周期;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,DAPI染色法验证细胞凋亡,然后进行以下实验初步探讨诱导凋亡的机制:用JC-1探针检测线粒体膜电位的变化;western blot检测凋亡相关蛋白、线粒体途径相关蛋白的变化;MDC染色法检测细胞自噬,western blot检测自噬相关的蛋白的表达;细胞划痕检测细胞迁移能力;western blot检测细胞组蛋白H4的乙酰化水平。

结果:1.saha抑制了rd细胞的增殖,并且具有时间和浓度依赖性。saha作用于RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞系细胞24h、48h、72h的半数抑制率ic50值分别为8.503μmol//l、3.965μmol/l和1.921μmol/l;与rd细胞增殖相关erk信号通路的变化是:erk蛋白磷酸化水平下降,而总erk蛋白水平没有显著的变化;

2. 流式细胞术结果显示saha使RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞系细胞发生g2/m期阻滞;

3. annexinv-fitc/pi双染法结果显示saha能够诱导RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞系细胞凋亡;dapi染色法实验表明,随着saha浓度的增加,凋亡细胞的数量随之增加,jc-1流式细胞术结果显示,随着saha浓度的增高,rd细胞线粒体膜电位水平逐渐降低;westernblot结果显示:随着saha浓度的增高,凋亡相关蛋白caspase-3和parp-1表达量增高,抗凋亡蛋白bcl-2表达量逐渐减低,促凋亡蛋白bax表达量逐渐增加,细胞色素c和caspase-9的表达也均有所增加;

4. saha使RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞系细胞发生自噬:mdc染色结果显示随着saha浓度的增高,细胞内的高亮点状绿色荧光的斑点数量逐渐增多,表明细胞发生自噬。westernblot结果显示:随着saha浓度的增高,p62蛋白表达逐渐减少,beclin1蛋白表达水平逐渐增高,lc3-Ⅱ蛋白的表达也显著增高。

5. saha抑制RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞系细胞的迁移:细胞划痕实验结果显示:随着saha浓度的增高,划痕愈合率逐渐降低。

6. westernblot结果显示:随着saha浓度的增高,RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞系组蛋白h4的乙酰化水平逐渐增高。

结论:1.hdac抑制剂saha抑制RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞系细胞的增殖,使RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞系细胞发生g2/m期阻滞,该抑制作用具有时间和浓度依赖性;

2. hdac抑制剂saha诱导RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞系细胞的凋亡,介导凋亡的机制可能为依赖于线粒体途径和具有caspase依赖性;

3. hdac抑制剂saha诱导RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞系细胞自噬;

4.hdac抑制剂saha抑制RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞系细胞的迁移能力。

参考文献

[1]Design,synthesis and evaluation of antiestrogen and histone deacetylase inhibitor molecular hybrids.Rodrigo Mendoza-Sanchez;;David Cotnoir-White;;Justyna Kulpa;;Isabel Jutras;;Joshua Pottel;;Nicolas Moitessier;;Sylvie Mader;;James L.Gleason.Bioorganic&Medicinal Chemistry,2015

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