小鼠视网膜MULLER细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠视网膜MULLER细胞是小鼠视网膜中的一种胶质细胞，主要位于视网膜神经纤维层(RNFL)和内丛状层(IPL)。小鼠视网膜MULLER细胞具有多种功能，包括维持视网膜内环境稳定、参与光感受器信号传导、支持视网膜血管生长等。

在视觉信号传导过程中，小鼠视网膜MULLER细胞通过与视网膜神经元之间的突触连接，将光感受器产生的电信号转化为化学信号，进而传递给神经元。此外，小鼠视网膜MULLER细胞还参与调节视网膜血流，为视网膜提供充足的氧气和营养物质。

近年来，研究发现小鼠视网膜MULLER细胞在视网膜病变(如年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变等)的发生和发展中发挥重要作用。因此，对小鼠视网膜MULLER细胞的研究有助于深入了解视网膜疾病的发病机制，为临床治疗提供新的靶点。

小鼠视网膜MULLER细胞

小鼠视网膜MULLER细胞培养操作

1)复苏小鼠视网膜MULLER细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)小鼠视网膜MULLER细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)小鼠视网膜MULLER细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

小鼠视网膜MULLER细胞可以用于TXNIP在高糖诱导小鼠视网膜Müller细胞自噬中的作用及相关机制研究

探讨硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)对高糖诱导的小鼠视网膜Müller细胞自噬的影响及其可能机制。

方法:采用高糖及低氧诱导体外培养的小鼠视网膜MULLER细胞,通过siRNA干扰降低TXNIP的表达,通过免疫荧光、Western blot和Real-time PCR等方法检测TXNIP及自噬相关蛋白(微管相关蛋白1轻链3ɑ(microtubule associated protein 1 light chain 3 alpha,LC3Ⅱ)、Sequestosome1(p62/SQSTMl))的表达及丝氨酸/苏氨酸激酶/雷帕霉素靶蛋白(serine/threonine kinase 1/mechanistic target of rapamycin kinase,AKT/mTOR)的表达。结果:细胞荧光免疫提示在高葡萄糖条件下,TXNIP的表达明显增加,,GS的表达则有所下降(p<0.01);而在TXNIP敲低组TXNIP的表达明显减少,而GS的表达增加(p<0.01);Western blot和Real-time PCR结果提示经过高糖和低氧诱导的小鼠视网膜MULLER细胞中TXNIP、LC3II、p62/SQSTMl的表达均显著增加(P<0.05);而将TXNIP敲低后的小鼠视网膜MULLER细胞中自噬相关特征性蛋白(LC3Ⅱ、P62)的表达则显著降低(P<0.05);且高糖诱导的小鼠视网膜MULLER细胞p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平呈显著上调趋势(P<0.01);敲低TXNIP表达后p-Akt、p-mToR蛋白表达水平出现对应降低(P<0.05)。

结论:研究表明TXNIP在高糖诱导的小鼠视网膜MULLER细胞中可能通过Akt/mTOR信号通路抑制细胞自噬活性,并引起细胞凋亡。因此,如何将小鼠视网膜MULLER细胞中TXNIP抑制表达可能成为下一阶段治疗DR以及相关血管性病变的研究热点,而TXNIP对自噬及相关机制的进一步研究或将成为未来DR研究的靶点。

参考文献

[1]Salidroside alleviates high glucose-induced oxidative stress and extracellular matrix accumulation in rat glomerular mesangial cells by the TXNIP-NLRP3 inflammasome pathway.Shiying Wang;;Xinxin Zhao;;Suxia Yang;;Baoping Chen;;Jun Shi.Chemico-Biological Interactions,2017

[2]Modulation of IL-1βand VEGF expression in rat diabetic retinopathy after PACAP administration.Agata Grazia D’Amico;;Grazia Maugeri;;Daniela Maria Rasà;;Claudio Bucolo;;Salvatore Saccone;;Concetta Federico;;Sebastiano Cavallaro;;Velia D’Agata.Peptides,2017

[3]Geniposide accelerates proteasome degradation of Txnip to inhibit insulin secretion in pancreaticβ-cells.C.Y.Liu;;Y.N.Hao;;F.Yin;;Y.L.Zhang;;J.H.Liu.Journal of Endocrinological Investigation,2017

[4]New perspectives on mTOR inhibitors(rapamycin,rapalogs and TORKinibs)in transplantation.Matthias Waldner;;Daniel Fantus;;Mario Solari;;Angus W.Thomson.British Journal of Clinical Pharmacology,2016

[5]张敏.TXNIP在高糖诱导小鼠视网膜Müller细胞自噬中的作用及相关机制研究[D].上海交通大学,2020.