HRC-99人直肠腺癌贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

HRC-99人直肠腺癌贴壁细胞系是一种来源于人直肠腺癌组织的贴壁细胞系。这种细胞系通常用于研究直肠癌的发生、发展和治疗等方面的实验。

HRC-99人直肠腺癌贴壁细胞系的建立通常是通过将直肠癌组织进行体外培养，然后进行细胞分离、传代和鉴定得到的。这种细胞系具有贴壁生长的特性，需要在塑料培养皿或玻璃培养瓶中贴壁培养。

HRC-99人直肠腺癌贴壁细胞系可以用于各种实验，如细胞增殖、细胞凋亡、药物筛选和治疗等。通过观察这些细胞的生长、形态和分子表达等指标，可以帮助人们更好地了解直肠癌的生物学特性和治疗策略。

HRC-99人直肠腺癌贴壁细胞系

HRC-99人直肠腺癌贴壁细胞系细胞培养操作

1)复苏HRC-99人直肠腺癌贴壁细胞系细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)HRC-99人直肠腺癌贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)HRC-99人直肠腺癌贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

HRC-99人直肠腺癌贴壁细胞系可以用于局部进展期中低位直肠癌术前新辅助治疗反应影响因素的筛选

局部进展期中低位直肠癌辐射抗拒相关Micro RNA的筛选目的:构建中低位局部进展期直肠癌人源性肿瘤动物模型(patient-derived xenograft,PDX)并对荷瘤裸鼠和5个直肠癌细胞株的放疗反应能力进行检测,筛选出与辐射抗拒呈正相关mi RNA和辐射抗拒的直肠癌细胞株。

方法:1.于术中自河北医科大学第四医院外二科获得中低位局部进展期直肠癌患者的新鲜手术肿瘤组织标本,将标本锐性分离为两等份:其中一份冻存于-150℃冰箱内,另一份接种于荷兰裸鼠肩部/臀部构建PDX模型。

2. 采用单次16Gy的辐射剂量照射PDX模型的肿瘤部位,于辐射后10天测量移植瘤的体积并处死荷瘤鼠、剥离瘤组织进行HE染色,评价移植瘤对辐射反应情况。

3. 根据移植瘤对辐射反应的评价结果,筛选出接受辐射后肿瘤组织学达到病理完全反应(pathologic complete response,p CR)的标本和无/低反应(no/low response,N/L R)的标本各3例,将与其对应的冻存于-150℃冰箱内的标本进行mi RNA芯片检测,筛选出差异表达fold change值>2.0的mi RNA,并采用q RT-PCR检测方法对筛选出的差异mi RNA在直肠癌组织中进行验证。

4.传代培养HRC-99人直肠腺癌贴壁细胞系、HR-8348、SW1463、SW837、RCM-1细胞系,将这5种细胞按照一定数量分别种植于培养皿,待细胞贴壁后分别进行单次剂量为0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy的放射线照射,进行辐射干扰下的克隆形成实验,继而筛选出对辐射抗拒的细胞株。5.根据mi RNA芯片的筛选结果和组织验证的结果,采用q RT-PCR技术,对可能导致直肠癌辐射抗拒性增高的mi RNA在上述5个直肠癌细胞系中的表达量进行检测,筛选可能与直肠癌放疗抗拒相关的mi RNA。

结果:1.接种直肠癌组织10天后发现PDX模型的构建成功率为76.79%(43/56),在43只荷瘤裸鼠的肩部/臀部共形成55个肿瘤,移植瘤的最大直径约为8mm-16mm(1.0±0.45),中位值为11mm。

2. 依据放射治疗后直肠癌组织学退缩分级(RCRG)标准评价移植瘤对辐射的反应,结果发现RCRG 1级的标本11例,RCRG 2级的标本26例,RCRG 3级的标本6例。

3. mi RNA芯片检测结果显示共有14个fold change值>2.0的mi RNA,其中在对辐射抗拒的肿瘤组织中表达上调的有4个分别是mi RNA-552-3p、mi RNA-96-5p、mi RNA-182-5p、mi RNA-183-5p;下调有10个分别是mi RNA-3138、mi RNA-4800-5p、mi RNA-6510-5p、mi RNA-7847-3p、mi RNA-345-3p、mi RNA-1236-5p、mi RNA-6775-5p、mi RNA-1273g-3p、mi RNA-145-5p、mi RNA-381-3p,进一步在直肠癌组织中进行q RT-PCR验证显示mi RNA-552-3p、mi RNA-96-5p、mi RNA-182-5p、mi RNA-183-5p、mi RNA-3138、mi RNA-381-3p、mi RNA-1236-5p、mi RNA-145-5p的验证结果与mi RNA芯片筛选获得的结果具有相同的趋势。

4.辐射干扰下的克隆形成实验结果显示5个直肠癌细胞系对放射线的抗拒性由强到弱依次为HR-8348>HRC-99人直肠腺癌贴壁细胞系>RCM-1>SW837>SW1463。

参考文献

[1]MiR-183-5p is required for non-small cell lung cancer progression by repressing PTEN.Huimin Wang;;Zhongliang Ma;;Xiaomin Liu;;Caiyan Zhang;;Yanping Hu;;Lei Ding;;Pengfei Qi;;Ju Wang;;Shengdi Lu;;Yanli Li.Biomedicine&Pharmacotherapy,2019

[2]Enhancing the Radiation Response in KRAS Mutant Colorectal Cancers Using the c-Met Inhibitor Crizotinib.Kyle C.Cuneo;;Ranjit K.Mehta;;Himabindu Kurapati;;Dafydd G.Thomas;;Theodore S.Lawrence;;Mukesh K.Nyati.Translational Oncology,2019

[3]miR‐381‐3p restrains cervical cancer progression by downregulating FGF7.Anquan Shang;;Cheng Zhou;;Ganxia Bian;;Wei Chen;;Wenying Lu;;Weiwei Wang;;Dong Li.Journal of Cellular Biochemistry,2019

[4]UGT 1A1 polymorphisms in rectal cancer associated with the efficacy and toxicity of preoperative chemoradiotherapy using irinotecan.Kei Kimura;;Tomoki Yamano;;Masataka Igeta;;Ayako Imada;;Song Jihyung;;Akihito Babaya;;Michiko Hamanaka;;Masayoshi Kobayashi;;Kiyoshi Tsukamoto;;Masafumi Noda;;Masataka Ikeda;;Naohiro Tomita.Cancer Science,2018

[5]吴凤鹏.局部进展期中低位直肠癌术前新辅助治疗反应影响因素的筛选[D].河北医科大学,2021.