TE 671 人胚胎横纹肌瘤细胞系的应用

背景^[1-3]

TE 671人胚胎横纹肌瘤细胞系来源于胚胎性横纹肌肉瘤，培养基为GIBCO。这种细胞系为贴壁生长型。TE 671人胚胎横纹肌瘤细胞系的具体应用和实验要求可能会因研究类型而异。

TE 671人胚胎横纹肌瘤细胞系

TE 671人胚胎横纹肌瘤细胞系培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备基础培养基(GIBCO，添加NaHCO3 1.5g/L，丙酮酸钠0.11g/L)；优质胎牛血清，10%。

2）TE 671人胚胎横纹肌瘤细胞系培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）TE 671人胚胎横纹肌瘤细胞系冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

二．TE 671人胚胎横纹肌瘤细胞系细胞处理：

1）复苏TE 671人胚胎横纹肌瘤细胞系细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）TE 671人胚胎横纹肌瘤细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）TE 671人胚胎横纹肌瘤细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

应用^[4-5]

TE 671人胚胎横纹肌瘤细胞系可以用于MicroRNAs在病毒性心肌炎发病中调控作用的初步研究和新型柯萨奇病毒CVB3减毒株的构建与筛选

探索柯萨奇病毒非编码区外源microRNA插入的稳定性。

目的：利用pCMV5/CVB3感染性克隆质粒,在其CVB3序列两侧的5’端与3’端非编码区分别插入心肌组织特异的内源性microRNAs的互补序列,构建含miRNAs互补序列的重组CVB3病毒,观察其复制的稳定性,为新型CVB3分子减毒疫苗株的研究奠定基础。

方法：利用分子克隆技术和microRNA的操作技术,将合成单一和三串联的miRNAs经退火制备成双链miRNAs,分别在CVB3序列的5’UTR和3’UTR选点插入。用重组病毒质粒转染Hela细胞,观察其能否恢复为完整的病毒颗粒,将重组病毒感染TE 671人胚胎横纹肌瘤细胞系细胞,并提取病毒RNA进行测序鉴定。

结果：5’端插入构建的重组病毒质粒经测序确定后,将其转染不含内源性miR-133的Hela细胞后能够转录出完整的病毒颗粒,细胞产生明显病变,并且用RT-PCR及WesternBlot鉴定为完整病毒颗粒。感染含有内源性miR-133的TE 671人胚胎横纹肌瘤细胞系细胞不出现病变,证明内源性miR-133识别重组CVB3序列中的miR-133互补链并产生对CVB3复制及翻译抑制作用。当在Hela细胞连续传3代后,再用重组病毒感染含有miR-133序列的TE 671人胚胎横纹肌瘤细胞系细胞也出现病变,提取重组病毒RNA测序发现miR-133序列被切除,相邻的病毒序列没有发生改变。做重复实验得到同样的结果。因此继续在3’端寻找构建点,经多步克隆完成构建,重组病毒质粒转染Hela细胞后能够转录出完整的病毒颗粒,复制良好。目前正在用重组病毒感染含有miR-133的TE 671人胚胎横纹肌瘤细胞系细胞并观察,同时进行多次传代观察其插入稳定性。

结论：在CVB3基因组5’UTR的BstBI位点插入外源miR-133互补序列后,由于5’UTR功能区较多,影响了病毒的复制,并导致病毒基因组出现不稳定,经多次传代后易发生病毒回复的情况。病毒在复制过程中把外源序列切除的目的是保证其基因组在进化上的稳定性。因此认为在构建重组CVB3病毒时,避开5’UTR该位点区。目前观察到3’UTR区插入外源序列无论从理论上和实际的结果上还是存在可行性的。

参考文献

[1]Reduced Degradation of the Chemokine MCP-3 by Matrix Metalloproteinase-2 Exacerbates Myocardial Inflammation in Experimental Viral Cardiomyopathy..Circulation,2011

[2]Destabilization of Coxsackievirus B3 Genome Integrated with Enhanced Green Fluorescent Protein Gene.Tong,Lei;;Lin,Lexun;;Zhao,Wenran;;Wang,Bo;;Wu,Shuaiqin;;Liu,Huimin;;Zhong,Xiaoyan;;Cui,Yuqiong;;Gu,Hongxia;;Zhang,Fengmin;;Zhong,Zhaohua.EN,2011

[3]Changes in microRNA expression induced by rabies virus infection in mouse brains.Pingsen Zhao;;Lili Zhao;;Tao Zhang;;Hualei Wang;;Chuan Qin;;Songtao Yang;;Xianzhu Xia.Microbial Pathogenesis,2011

[4]The Coxsackievirus B 3Cpro Protease Cleaves MAVS and TRIF to Attenuate Host Type I Interferon and Apoptotic Signaling.Amitava Mukherjee;;Stefanie A.Morosky;;Elizabeth Delorme-Axford;;Naomi Dybdahl-Sissoko;;M.Steven Oberste;;Tianyi Wang;;Carolyn B.Coyne.PLOS Pathogens,2011

[5]张庆华.MicroRNAs在病毒性心肌炎发病中调控作用的初步研究和新型柯萨奇病毒CVB3减毒株的构建与筛选[D].北京协和医学院,2013.