变形丝囊霉菌PCR试剂盒的应用

背景^[1-3]

变形丝囊霉菌PCR试剂盒是一种用于检测和诊断变形丝囊霉菌的工具。该试剂盒包含了Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2和反应缓冲液等成分，具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点。

变形丝囊霉菌PCR试剂盒的引物经过优化，反应特异性强，可以最大限度地减少人为误差，提高检测准确性和重复性。同时，该试剂盒采用即开即用的设计，方便快捷，适用于变形丝囊霉菌的检测、诊断和流行病学调查。

变形丝囊霉菌PCR试剂盒就是为此目的根据PCR原理开发的试剂盒，它具有下列特点：

1.即开即用，用户只需要提供DNA模板。

2.引物经过精心优化，专一性强，只扩增变形丝囊霉菌，与其他病毒没有交叉反应。

3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4.PCR mix中含上样染料，PCR后可以直接上样电泳。

5.本试剂盒足够做40μL体系的PCR 50次，但只能用于科研。

变形丝囊霉菌PCR试剂盒采用PCR技术，针对变形丝囊霉菌的基因高度保守区域设计特异性引物，用PCR技术对变形丝囊霉菌的核酸进行体外扩增检测，在反应体系中含变形丝囊霉菌核酸模板的情况下，PCR反应进行特异性扩增，利用琼脂糖凝胶电泳技术对PCR扩增产物进行检测，依据特异性扩增片段的结果，判断待检样品中是否含有猪细小病毒源性成分，实现检测结果的定性分析。

变形丝囊霉菌PCR试剂盒样品要求

1.根据实际情况可采取食品、粪便、呕吐物、口腔样本，唾液、咽喉部鼻孔眼部和肛门拭子及病毒培养物作为检测样本。

2.应避免样本间交叉污染，样本采集后应及时检测，也可保存于-20±5℃待检，长期保存应置于-70℃以下。

变形丝囊霉菌PCR试剂盒

变形丝囊霉菌PCR试剂盒使用方法

1.样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

取悬浮的口腔样本或粪便样本100ul，加入1.5ml离心管中，用DNA核酸提取试剂盒进行提取即可。

1.2变形丝囊霉菌PCR试剂盒DNA提取

根据您实验室的具体情况和样品类型，选择适当的提取策略方法。为了使实验结果稳定、有效、可靠，我们建议使用商品化的试剂盒进行提取，严格按照对应试剂盒说明书进行操作，样本核酸提取过程中应避免污染，提取好的模板样品如不能立即检测，建议-15℃以下保存。

2.变形丝囊霉菌PCR试剂盒试剂配制（试剂准备区）

2.1从-15℃以下冰箱中取出试剂盒平衡到室温（20～25℃），注意避免强光照射，待完全溶解后振荡混匀并低速离心10 s，使用低吸附吸头分液取样，避免试剂损失和浪费。

2.2根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照；样品每满7份，多配制1份)，

2.3在适当容积的无菌离心管中加入上述试剂，充分振荡混匀后2000 rpm离心10 s，按照20μL/管分装量将试剂分装至八联PCR反应管中。

2.4盖紧八联PCR反应管盖,并注意做好相应标识（请标记在八联PCR反应管盖两端突出部位，切勿标记在八联PCR反应管盖中间）。将PCR反应管转移至样本准备区，剩余试剂放回-15℃以下冰箱冷冻保存。

3.变形丝囊霉菌PCR试剂盒加样（样本处理区）

将步骤1提取的DNA、阳性质控品、阴性质控品各取5μL，加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心，核酸加样过程中应避免污染。

备注：模板浓度高或存在PCR抑制物，需用超纯水稀释模板DNA，DNA浓度低于50ng/ul，可加5μL模板，高浓度DNA可能抑制PCR反应。

4.PCR扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于PCR仪反应槽内,并记录放置顺序；

5.变形丝囊霉菌PCR试剂盒结果分析判定

5.1电泳检测

取10-20μL PCR产物。电泳检测PCR产物。本产品提供的扩增液在扩增结束后可以直接上样，不需要另外再加loading buffer。

5.2电泳结果判断

PCR产物阳性对照必须有目的片段大小的条带出现，阴性对照必须无任何扩增，否则实验无效。对没有扩增产物的样品，可以稀释10倍后重复PCR扩增以排除PCR抑制剂的感染。

应用^[4-5]

变形丝囊霉菌PCR试剂盒可以用于大豆疫霉延胡索酸还原酶PsFRD基因克隆与功能分析

分离和克隆灭蚊真菌卡地腐霉(Pythiumcarolinianum)Pr1蛋白酶(subtilisin likeprotease)的cDNA片段。

方法:用1%的几丁质悬液诱导培养卡地腐霉菌丝30h,然后按下述流程操作:抽提菌丝的总RNA;逆转录合成cDNA第一链;根据Pr1的保守氨基酸序列设计合成一对简并引物,以cDNA第一链为模板,用MOPAC方法(MixedoligonucleotidesprimedamplificationofcDNA)扩增cDNA;将扩增产物纯化、连入pGEM T载体,转化大肠杆菌DH5α用于测序。使用变形丝囊霉菌PCR试剂盒筛选真菌Aphanomycesastaci抽提菌丝的总RNA;逆转录合成cDNA第一链;根据Pr1的保守氨基酸序列设计合成一对简并引物,以cDNA第一链为模板,用MOPAC方法(MixedoligonucleotidesprimedamplificationofcDNA)扩增cDNA;将扩增产物纯化、连入pGEM T载体,转化大肠杆菌DH5α用于测序。

结果:所获片段中,1个5 30bp的cDNA片段与枯草杆菌类蛋白酶基因有较高的相似性,尤其与真菌Aphanomycesastaci(卵菌纲、水霉目)的Pr1在核苷酸序列及翻译得到的氨基酸序列水平有较高的相似性,分别为5 9%和4 9%。此序列已登录Genbank数据库,检索号:AF4 990 0 6。P.car olinianum与A.astaciPr1部分cDNA序列的比对亦登录Genbank数据库,检索号:AY0 94 976,AY0 94 977。

结论:这一DNA片段可能是卡地腐霉Pr1蛋白酶的一条cDNA片段。更进一步的工作是设法获得全长cDNA片段,并加以证实。

参考文献

[1]CDD/SPARCLE:functional classification of proteins via subfamily domain architectures.Aron Marchler-Bauer;;Yu Bo;;Lianyi Han;;Jane He;;Christopher J.Lanczycki;;Shennan Lu;;Farideh Chitsaz;;Myra K.Derbyshire;;Renata C.Geer;;Noreen R.Gonzales;;Marc Gwadz;;David I.Hurwitz;;Fu Lu;;Gabriele H.Marchler;;James S.Song;;Narmada Thanki;;Zhouxi Wang;;Roxanne A.Yamashita;;Dachuan Zhang;;Chanjuan Zheng;;Lewis Y.Geer;;Stephen H.Bryant.Nucleic Acids Research,2017

[2]A novel protein elicitor(SsCut)from Sclerotinia sclerotiorum induces multiple defense responses in plants.Huajian Zhang;;Qun Wu;;Shun Cao;;Tongyao Zhao;;Ling Chen;;Peitong Zhuang;;Xiuhong Zhou;;Zhimou Gao.Plant Molecular Biology,2014

[3]Mitochondrial fumarate reductase as a target of chemotherapy:From parasites to cancer cells.Chika Sakai;;Eriko Tomitsuka;;Hiroyasu Esumi;;Shigeharu Harada;;Kiyoshi Kita.BBA-General Subjects,2011

[4]Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs.Richard W.Carthew;;Erik J.Sontheimer.Cell,2009

[5]施晓鋆,苏晓庆.卡地腐霉Pr1蛋白酶cDNA片段的分离和克隆[J].贵阳医学院学报,2003(01):1-4.