SV40转染人成骨细胞的应用

背景^[1-3]

SV40转染人成骨细胞是一种通过将SV40病毒载体转染到人成骨细胞中建立起来的细胞系。SV40是一种常见的病毒载体，可用于将外源基因导入细胞内，并使基因在细胞内表达。这种转染方法可用于研究人成骨细胞的生物学特性、药物筛选和抗肿瘤药物开发等。

SV40转染人成骨细胞的培养实验室具体要求主要取决于开展的研究类型。所有细胞培养实验室都要求内部没有致病性微生物存在（即：无菌），并且均有一些相同的细胞培养必需基本设备。例如，水浴锅、细胞计数器（例如：Countess®自动细胞计数器或血球计数器）、倒置显微镜、液氮冷冻柜或冻存容器、灭菌器（即：高压灭菌器）等。

在操作SV40转染人成骨细胞前后，应保持良好的个人卫生，并遵循无菌操作规程。细胞在运输和保存过程中需采取相应的包装和运输方式，以确保细胞的活性和稳定性。对于收到细胞后的处理和培养，应遵循一定的操作步骤和要求，例如检查是否有运输问题、进行细胞计数和传代等。在培养过程中还需注意观察细胞的生长状态和形态，并及时进行传代或更换培养液。

SV40转染人成骨细胞

SV40转染人成骨细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备基础培养基(GIBCO，添加NaHCO3 1.5g/L，丙酮酸钠0.11g/L)；优质胎牛血清，10%。

2）SV40转染人成骨细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）SV40转染人成骨细胞冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

二．SV40转染人成骨细胞细胞处理：

1）复苏SV40转染人成骨细胞细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）SV40转染人成骨细胞细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）SV40转染人成骨细胞细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

应用^[4-5]

SV40转染人成骨细胞可以用于核仁素的表达在骨肉瘤细胞凋亡中的作用

选择p53野生型人骨肉瘤细胞株U-2OS、p53变异型人骨肉瘤细胞株MG-63和p53缺失型人骨肉瘤细胞株Saos-2,并选择永生化人成骨细胞hFOB1.19(SV40转染人成骨细胞)作为正常对照,定性了解上述细胞正常情况下核仁素和bcl-2的表达情况,并利用MTT实验研究顺铂对上述骨肉瘤细胞株的增值抑制作用。

方法：取指数生长期的U-2OS、MG-63、Saos-2和SV40转染人成骨细胞,提取总RNA,逆转录得到cDNA,分别设计针对核仁素、bcl-2和内参GAPDH的PCR引物,进行PCR检测核仁素和bcl-2在人成骨肉瘤中的基因表达；分别提取细胞总蛋白,胞蛋白,利用免疫印迹法(Western blotting)检测细胞中核仁素和bcl-2蛋白表达水平；利用MTT,检测顺铂对不同P53功能状态的骨肉瘤细胞凋亡抑制作用。

结果：免疫印迹法(Western blotting)和RT-PCR结果显示,在骨肉瘤细胞株U-2OS、MG-63、Saos-2和SV40转染人成骨细胞中,均检测到了核仁素和bcl-2基因和蛋白的表达。与正常人成骨细胞hFOB1.19相比较,U-2OS、MG-63和Saos-2的核仁素和bcl-2基因和蛋白表达水平均显著增高。顺铂对不同骨肉瘤细胞株均有明显的抑制作用,并且可能和核仁素的表达水平相关。

结论：不同P53突变状态的骨肉瘤细胞系与成骨细胞比较,核仁素过表达的同时伴随bcl-2过表达。顺铂对不同骨肉瘤细胞株增值抑制作用可能与核仁素的表达水平相关。既初步验证了我们试验条件的可行性,又为进一步的研究打下了基础：可以进一步研究P53不同功能状态下,使用反义核仁素寡核苷酸对顺铂诱导的化疗敏感性的影响及进一步用RNA-CHIP等实验研究核仁素和bcl-2之间的相互作用,为进一步研究核仁素在骨肉瘤凋亡中的作用打下基础。

参考文献

[1]Cell-surface nucleolin is sequestered into EPEC microcolonies and may play a role during infection..Dean Paul;;Kenny Brendan.Microbiology(Reading,England),2011

[2]Emerging drugs for high-grade osteosarcoma.Claudia Maria Hattinger;;Michela Pasello;;Stefano Ferrari;;Piero Picci;;Massimo Serra.Expert Opinion on Emerging Drugs,2010

[3]Inhibition of BCL-2 in small cell lung cancer cell lines with oblimersen,an antisense BCL-2 oligodeoxynucleotide(ODN):in vitro and in vivo enhancement of radiation response..Loriot Yohann;;Mordant Pierre;;Brown Bob D;;Bourhis Jean;;Soria Jean-Charles;;Deutsch Eric.Anticancer research,2010

[4]The E2F1/Rb and p53/MDM2 Pathways in DNA Repair and Apoptosis:Understanding the Crosstalk to Develop Novel Strategies for Prostate Cancer Radiotherapy.Thirupandiyur Udayakumar;;Mohammed M.Shareef;;Dayssy A.Diaz;;Mansoor M.Ahmed;;Alan Pollack.Seminars in Radiation Oncology,2010

[5]张朝贵.核仁素的表达在骨肉瘤细胞凋亡中的作用[D].中南大学,2012.