K7M2-WT 小鼠骨肉瘤成骨细胞系的应用

背景^[1-3]

K7M2-WT小鼠骨肉瘤成骨细胞系是一种小鼠骨肉瘤成骨细胞系，这种细胞系在Balb/c小鼠中形成肿瘤，并且在超过90%的接种小鼠中自发转移到肺部。这种细胞系的抗原表达包括Ⅷ因子、整合唾液酸蛋白（BSP）、二聚糖、饰胶蛋白聚糖、绒毛蛋白等。此外，骨唾液酸蛋白、二聚糖、饰胶蛋白聚糖和骨调素的表达显示了K7M2-WT细胞骨家族细胞特性。

K7M2-WT小鼠骨肉瘤成骨细胞系培养注意事项

1该细胞对外界刺激较为敏感，建议使用新鲜的DMEM高糖培养基，培养基出现发紫现象时不建议继续使用，且及时更换新鲜培养基；

2该细胞贴壁不牢，会有部分细胞悬浮。换液时勿用PBS进行冲洗，悬浮细胞过多时可离心收集再放回原培养瓶；

3该细胞传代时请注意消化程度，请勿消化过度。

K7M2-WT小鼠骨肉瘤成骨细胞系

K7M2-WT小鼠骨肉瘤成骨细胞系培养步骤：

1）复苏K7M2-WT小鼠骨肉瘤成骨细胞系细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）K7M2-WT小鼠骨肉瘤成骨细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1、对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打K7M2-WT小鼠骨肉瘤成骨细胞系细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将K7M2-WT小鼠骨肉瘤成骨细胞系细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

3）K7M2-WT小鼠骨肉瘤成骨细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。弃培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入到冻存液中。

应用^[4-5]

K7M2-WT小鼠骨肉瘤成骨细胞系可以用于曲古霉素通过自噬途径对K7M2 wt细胞凋亡的影响

研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素(TSA)对小鼠骨肉瘤K7M2-WT小鼠骨肉瘤成骨细胞系细胞增殖的抑制作用,并从凋亡和自噬途径探究其作用机制。

方法：CCK-8法检测TSA对K7M2-WT小鼠骨肉瘤成骨细胞系细胞增殖的影响;流式细胞术(FCM)检测K7M2-WT小鼠骨肉瘤成骨细胞系细胞凋亡率;Western blot检测TSA对K7M2-WT小鼠骨肉瘤成骨细胞系细胞凋亡和自噬相关蛋白表达的影响;用自噬抑制剂研究自噬对细胞凋亡的影响。

结果：CCK-8结果显示TSA对K7M2-WT小鼠骨肉瘤成骨细胞系细胞增殖有显著抑制作用,且呈浓度和时间依赖性;FCM结果显示TSA能够诱导K7M2-WT小鼠骨肉瘤成骨细胞系细胞凋亡;Western blot结果显示TSA能够上调促凋亡蛋白caspase-3和Bax表达,下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达;同时上调自噬标志蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达;自噬抑制剂能够增加TSA对K7M2-WT小鼠骨肉瘤成骨细胞系细胞的凋亡作用。

结论：自噬参与了TSA诱导K7M2-WT小鼠骨肉瘤成骨细胞系细胞凋亡的过程,且在该过程中对细胞起到保护作用。

参考文献

[1]Histone Deacetylase Inhibitor Trichostatin a Promotes the Apoptosis of Osteosarcoma Cells through p53 Signaling Pathway Activation.Deng Z;Liu X;Jin J;Xu H;Gao Q;Wang Y;Zhao J.Int J Biol Sci.2016

[2]Targeted therapy of osteosarcoma with radiolabeled monoclonal antibody to an insulin-like growth factor-2receptor(IGF2R).Geller DS;Morris J;Revskaya E.et al.Nucl Med Biol.2016

[3]A Trichostatin A(TSA)/Sp1-mediated mechanism for the regulation of SALL2 tumor suppressor in Jurkat T cells.Matías I.Hepp;;David Escobar;;Carlos Farkas;;Viviana E.Hermosilla;;ClaudiaÁlvarez;;Roberto Amigo;;JoséL.Gutiérrez;;Ariel F.Castro;;Roxana Pincheira.BBA-Gene Regulatory Mechanisms,2018

[4]Induction of Apoptotic Temperature in Photothermal Therapy under Various Heating Conditions in Multi-Layered Skin Structure.Kim Donghyuk;Kim Hyunjung.International Journal of Molecular Sciences,2021

[5]汪瑜,罗梅懿,黄歆等.曲古霉素通过自噬途径对K7M2 wt细胞凋亡的影响[J].重庆医学,2019,48(14):2345-2348.