EMSA试剂盒

背景^[1-7]

EMSA试剂盒是用于EMSA(也称gel shift)研究的一个试剂盒。通过EMSA可以研究目的蛋白和特定的DNA序列的结合情况，从而可以研究细胞内一些转录因子的激活水平。本试剂盒提供了进行EMSA实验的探针标记、蛋白和DNA结合以及EMSA上样等的主要试剂，使EMSA实验变得简单方便。EMSA结合缓冲液(5X)中含有poly(dI-dC)等有效成分。其中poly(dI-dC)的浓度经过优化，可以很好的消除蛋白和标记探针间的非特异性结合，同时又不会减弱目的转录因子和标记探针间的结合。

电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assays，EMSA），又叫凝胶阻滞电泳，是近年发展起来的研究核酸与蛋白质相互作用的简单、快速、敏感的方法，目前已经成为转录因子研究的经典方法。其基本原理是核酸与蛋白质发生作用时会形成核酸-蛋白质复合物，这种复合物在凝胶中比未结合蛋白质的核酸泳动速度慢，即形成一条相对滞后的条带。

该方法可用于检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白，并可通过加入特异性的抗体来检测特定的蛋白质。PIERCE将其卓越的SuperSignal®化学发光检测系统和DNA末端生物素标记技术应用于传统的EMSA，利用HRP标记的链亲和素与标记在DNA上的生物素之间的超强结合，使HRP固定在DNA上并催化发光底物反应发光，再通过X光片或冷光CCD检测。

EMSA原理：

EMSA一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

EMSA通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。

在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

特点：

1.安全环保：采用非同位素的化学发光检测系统，免除放射性的危险与处理同位素废物的麻烦，减少环境污染；无须专门的同位素操作室，易于使用推广。

2.高灵敏度：PIERCE的SuperSignal®Dura底物使检测灵敏度达到10-14克，等同于或者超过同位素标记系统。

3.快速省时：从标记探针到结果分析，全部实验只需5小时。

4.稳定可靠：DNA末端标记生物素，不影响蛋白结合位点。标记好的DNA可以保存一年。

5.配备完整：该试剂盒包括EBNA对照系统、化学发光检测系统等所有试剂，需要自备的只有生物素末端标记的DNA、蛋白质样品、尼龙膜和电泳设备。

应用^[8]

EMSA试剂盒可用于转录克隆蛋白的检测：

通过PCR扩增的方法从大豆品种Harosoy中克隆到1个新的b ZIP基因(Gmb ZIP71),基因表达分析表明Gmb ZIP71在叶片、生长点、花、花芽、荚和根等多个器官中表达。将Gmb ZIP71构建到原核表达载体p ET29b上,导入大肠杆菌BL21(DE3)中,对其进行IPTG诱导。结果表明:在IPTG浓度为0.25 mmol·L-1,诱导时间为4 h,诱导温度为28℃时,重组蛋白得到表达,分子量大约为48 k Da,SDS-PAGE电泳结果表明重组蛋白主要以包涵体形式存在,用His蛋白纯化系统回收得到Gmb ZIP71-His重组蛋白,EMSA(electrophoretic mobility shift assay)

参考文献

[1]Soybean GmbZIP44,GmbZIP62 and GmbZIP78 genes function as negative regulator of ABA signaling and confer salt and freezing tolerance in transgenic Arabidopsis[J].Yong Liao,Hong-Feng Zou,Wei Wei,Yu-Jun Hao,Ai-Guo Tian,Jian Huang,Yun-Feng Liu,Jin-Song Zhang,Shou-Yi Chen.Planta.2008(2)

[2]Identification of new ABA-and MEJA-activated sugarcane bZIP genes by data mining in the SUCEST database[J].Plant Cell Reports.2008(2)

[3]Structure-based Prediction of bZIP Partnering Specificity[J].Gevorg Grigoryan,Amy E.Keating.Journal of Molecular Biology.2005(5)

[4]Over‐expression of a transcription factor regulating ABA‐responsive gene expression confers multiple stress tolerance[J].Jin‐BaekKim,Jung‐YounKang,Soo YoungKim.Plant Biotechnology Journal.2004(5)

[5]bZIP transcription factors in Arabidopsis[J].Trends in Plant Science.2002(3)

[6]Intracellular localization of GBF proteins and blue light‐induced import of GBF2 fusion proteins into the nucleus of cultured Arabidopsis and soybean cells[J].Anthony R.Cashmore.The Plant Journal.2002(5)

[7]Two bZIP proteins from Antirrhinum flowers preferentially bind a hybrid C‐box/G‐box motif and help to define a new sub‐family of bZIP transcription factors[J].Jaime F.Martínez‐García,EnriquetaMoyano,Marcos J.C.Alcocer,CathieMartin.The Plant Journal.2002(4)

[8]刘晓兵,南海洋,袁晓辉,刘宝辉,孔凡江.大豆GmbZIP71基因的克隆及EMSA分析[J].大豆科学,2015,34(01):32-35+41.