PAGE不连续蛋白加样缓冲液(5×)的应用

背景^[1-3]

PAGE不连续蛋白加样缓冲液（5×）是一种用于蛋白质电泳的试剂，通常用于分离和分析不同分子量范围的蛋白质。

PAGE不连续蛋白加样缓冲液（5×）是一种用于蛋白质电泳的加样缓冲液。这种缓冲液的主要成分包括甘氨酸、Tris、SDS等，能够提高电泳分离蛋白质的效果。

在电泳过程中，蛋白质会通过电荷作用被推动通过凝胶，而PAGE不连续蛋白加样缓冲液中的成分可以促进蛋白质的迁移和分离。其中，甘氨酸和Tris能够提供pH缓冲能力，维持电泳过程中的pH稳定，而SDS则能够与蛋白质相互作用，帮助蛋白质在电场中的迁移。

使用PAGE不连续蛋白加样缓冲液（5×）时，通常按照1：5的比例将缓冲液与蛋白质样品混合，然后进行电泳分析。这种缓冲液的优点在于能够提供高浓度的蛋白质样品，并促进蛋白质的迁移和分离，从而提高电泳的灵敏度和分辨率。

PAGE不连续蛋白加样缓冲液(5×)

PAGE不连续蛋白加样缓冲液（5×）组成：PAGE不连续蛋白加样缓冲液(5×)通常由多种成分组成，包括Tris-HCl、甘氨酸、SDS等。这些成分可以协同作用，使蛋白质在电泳过程中保持稳定性并按照分子量大小分离。

浓度：PAGE不连续蛋白加样缓冲液(5×)的浓度通常为10X或更高，这意味着每毫升溶液中含有5毫克或更多的蛋白质。这种高浓度的缓冲液可以确保蛋白质在电泳过程中充分溶解和分离。

PAGE不连续蛋白加样缓冲液（5×）使用方法：使用PAGE不连续蛋白加样缓冲液(5×)时，需要将其与待测蛋白质混合后进行电泳。通常情况下，每个样品需要加入一定量的缓冲液，具体用量取决于待测蛋白质的浓度和所需的分辨率。

应用^[4-5]

PAGE不连续蛋白加样缓冲液（5×）可以用于常山酮对骨性关节炎的作用及机制研究

常山酮对软骨下骨MSCs细胞TGF-β介导的smad2/3信号通路的影响

1,体外培养MSCs,Western Blot观察常山酮对TGF-β通路的影响我们从Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute获得GFP标记的成年鼠骨髓间充质干细胞MSCs。细胞传至3-5代获得我们所需要的细胞量一部分进行试验一部分液氮冻存。培养基为Iscove’s modified Dulbecco’s medium(Invitrogen),辅以10%FCS(Atlanta Biologicals)、10%马血清(Thermo Scientific)以及1%青霉素-链霉素溶液(Mediatech)。细胞被培养在6孔板上,细胞的密度为1.8×10⁵/每孔。

待细胞长满培养皿后,提前予以添加常山酮(sc-211579,Santa Cruz Biotechnology)预处理4小时、8小时及12小时。于添加转化生长因子TGF-β(R&D Systems)前,饥饿细胞4小时。转化生长因子TGF-β与细胞作用30分钟。后提取蛋白,每孔加200微升的细胞裂解液和蛋白酶抑制剂的混合溶液。所有操作在冰上进行。

提取完蛋白后,将放于蛋白的试管放于冰中1小时,每10分钟震荡一次。后离心,13.2×103rpm,4度,10分钟。将离心后的蛋白定量。后取适度的蛋白的与PAGE不连续蛋白加样缓冲液(5×) 混合,100度水浴5-10分钟。蛋白电泳跑胶,首先配胶。10%下层胶(2块)：5.99毫升dd H2O、3.8ml PH8.8的下层胶缓冲液、5.01ml 30%ACR、224微升10%APS及10微升TEMED.8%上层胶(2块)：4毫升dd H2O、1.77ml PH6.8的下层胶缓冲液、1.2ml 30%ACR、112微升10%APS及10微升TEMED.将蛋白加样,60伏2-3小时。后将蛋白转膜至PVDF膜。后洗3遍,5分钟每次,5%milk封闭1小时,加入一抗4度过夜。

第二天,取出放在室温下20-30分钟,回收一抗。有洗液洗6遍,10分钟每次。加入二抗室温下1小时,后洗6遍,10分钟每次。后暗室内显色获得实验结果。

2,动物体内实验免疫染色MSCs和磷酸化的smad2/3我们应用免疫组化及免疫荧光的方法在动物体内进一步验证常山酮对软骨下骨转化生长因子TGF-β信号通路的影响。转化生长因子TGF-β信号通路的机制是细胞外的转化生长因子TGF-β配体与细胞膜上的转化生长因子TGF-β受体Ⅱ结合,后转化生长因子TGF-β受体Ⅱ将动员招募转化生长因子TGF-β受体Ⅰ,从而形成转化生长因子TGF-β受体复合物。

受体复合物继而诱导smad2/3磷酸化,磷酸化的smad2/3将于smad4结合形成复合物进而转至核内,转至核内的smad2/3和smad4的复合物将于相应基因结合,促进或抑制相应基因的转录和翻译,从而发挥其作用。免疫组化染色psmad2/3。实验分组动物被执行安乐死后,我们取鼠手术组及对照组的膝关节包括股骨下段和胫骨上段。先将膝关节固定24小时,三维CT扫描后更换为脱钙液(10%EDTA)脱钙3-4周。后将组织石蜡包埋,切片。切片厚度为4微米。切好的片子放于56度半小时,后保存于4度。染片时,前一天将片放于65度过夜。第二天,取出放于室温20-30分钟。依次过zylene3遍、100%酒精2遍、95%酒精及80%酒精。标本TBST洗3遍,5分钟每次。

同时配制1x抗原修复液预热于65度,将标本加入65度1x抗原修复液20分钟,后转至99.9度20分钟,后室温20分钟。倒掉抗原修复液,TBST洗3遍,5分钟每次。封闭笔花圈,加0.6%过氧化氢(H202)封闭10分钟。TBST冲洗,5分钟后再次冲洗放5分钟。后加3%BSA封闭1小时。配制一抗,加一抗4度过夜。第二天,拿出标本室温下放置20分钟。TBST洗涤3次,15分钟每次。加入二抗,室温放置1小时。TBST洗三次,每次15分钟。DAB显色,注意把握时间。复染细胞核(Hemotoxylin)约5-8秒。龙头水冲洗一次。醋酸(acetic acid)5秒,后氨水(ammonia water)约1分钟。一次过95%酒精、100%酒精两次及xylene3次。封片,照片采集。4度保存。

参考文献

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[5]崔壮.常山酮对骨性关节炎的作用及机制研究[D].南方医科大学,2016.