SNU-761人肝癌贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

SNU-761人肝癌贴壁细胞系是一种来源于人类肝癌的贴壁细胞系。这种细胞系是通过将人类肝癌组织移植到裸鼠体内，然后从移植瘤中分离出的一种细胞系。

SNU-761人肝癌贴壁细胞系

SNU-761人肝癌贴壁细胞系具有以下特点：

贴壁生长：该细胞系在培养基上能够贴壁生长，形成单层或多层的细胞集落。

高增殖能力：该细胞系具有较高的增殖能力，可以在短时间内快速扩增。

多向分化潜能：该细胞系具有多向分化潜能，可以分化为多种不同类型的细胞，包括肝细胞、胆管上皮细胞等。

表达多种肿瘤相关基因：该细胞系表达多种与肝癌相关的基因，如AFP、GPC3、HGF等。

SNU-761人肝癌贴壁细胞系细胞培养方法：

1、SNU-761人肝癌贴壁细胞系细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、SNU-761人肝癌贴壁细胞系细胞复苏：

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

3、SNU-761人肝癌贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入培养基终止消化；

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；

④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

应用^[4-5]

SNU-761人肝癌贴壁细胞系可以用于EGCG对人肝癌细胞的作用效果与PI3K-AKT信号通路关系的研究

探讨表没食子儿茶素没食子酸酯[(-)-Epigallocatechin-3-gallate，EGCG]对体外培养的人肝癌细胞生长、增殖及凋亡的影响，以及EGCG作用于人肝癌细胞后PI3K-AKT信号通路中相关信号分子mRNA和蛋白表达水平的变化。

方法：利用MTT法观察EGCG对HepG2、SMMC7721、Sk-hep1、SNU-761人肝癌贴壁细胞系等肝癌细胞的作用效果，并用吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）双染法观察肝癌细胞的形态学变化；流式细胞仪检测EGCG作用后SMMC7721细胞周期和凋亡的变化；实时荧光定量PCR（Real time-PCR）检测EGCG作用后SMMC7721细胞中EGFR、PI3K、AKT及NF-κB等信号分子mRNA表达的变化；Western Blotting验证SMMC7721细胞加入EGCG及联合加入PI3K抑制剂（LY294002）或PI3K通路激活剂（IGF-1）后AKT、p-AKT蛋白表达的变化。

结果：EGCG对HepG2、SMMC7721、SNU-761人肝癌贴壁细胞系的最佳作用浓度依次为74.7、59.6、61.3μg/ml，最佳作用时间是48h；EGCG作用后，三株肝癌细胞系贴壁细胞数量显著少于对照组，凋亡细胞增多[HepG2:（16.33±3.51vs3.67±1.15，P=0.004，P＜0.01），SMMC7721:（15.33±3.06vs3.33±2.08，P=0.005，P＜0.01），Sk-hep1:（18.33±2.31vs2.33±2.08，P=0.001，P＜0.01）]；

实验组S期占整个细胞周期的百分比为49.7%±1.2%，明显高于对照组S期22.1%±1.5%（P＜0.05）；实验组SNU-761人肝癌贴壁细胞系凋亡率（25.1%±4.2%）明显高于对照组（9.0%±2.7%）（P＜0.05）；Real time-PCR：实验组SMMC7721细胞中EGFR、PI3K、AKT、NF-κB的mRNA表达水平依次为76.3%±4.0%、68.3%±4.0%、71.0%±5.6%、57.3%±7.1%，均明显低于对照组（100.0%±0.0%）（P＜0.05）；Western Blotting：AKT的表达水平为：对照组（1.23±0.06）、LY294002组（0.53±0.11）、IGF-1组（2.14±0.14）、EGCG组（0.75±0.12）、EGCG+LY294002组（1.37±0.09）、EGCG+IGF-1组（1.56±0.12），p-AKT的表达水平为：对照组（0.70±0.11）、LY294002组（0.33±0.09）、IGF-1组（1.12±0.16）、EGCG组（0.25±0.18）、EGCG+LY294002组（0.71±0.07）、EGCG+IGF-1组（0.75±0.08），LY294002组及EGCG组明显低于对照组，IGF-1组明显高于对照组，EGCG+LY294002组及EGCG+IGF-1组明显高于EGCG组，差别均具有统计学意义（P＜0.05）。

结论：1、EGCG可抑制SNU-761人肝癌贴壁细胞系（抑制在S期），并促进其早期凋亡；

2、EGCG可能通过下调PI3K-AKT通路中相关信号分子的表达来抑制人肝癌细胞增殖，促进其凋亡。

参考文献

[1]Impact of antioxidants on the ability of phenolic phytochemicals to kill HCT116 colon cancer cells. A. Murphy;;K. Testa;;J. Berkelhammer;;S. Hopkins;;G. Loo.Free Radical Research,2014

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[4] Farnesol induces apoptosis of DU145 prostate cancer cells through thePI3K/Akt and MAPK pathways. Jin Park;;Jung Kwon;;Hye Kim;;Hyeong Kim;;Byeong Kim;;Ji Jung.International Journal of Molecular Medicine,2014

[5]张勇. EGCG对人肝癌细胞的作用效果与PI3K-AKT信号通路关系的研究[D].广西医科大学,2014.