PAGE连续蛋白上样缓冲液(5×)的应用

背景^[1-3]

PAGE连续蛋白上样缓冲液(5×)是一种用于蛋白质电泳的加样缓冲液，主要成分包括Tris-HCl、甘氨酸、溴酚蓝等。这种缓冲液的作用是提供高浓度的蛋白质样品，促进蛋白质的迁移和分离，从而提高电泳的灵敏度和分辨率。

使用PAGE连续蛋白上样缓冲液（5×）时，通常按照1：5的比例将缓冲液与蛋白质样品混合，然后进行电泳分析。这种缓冲液的优点在于能够提供高浓度的蛋白质样品，并促进蛋白质的迁移和分离，从而提高电泳的灵敏度和分辨率。

PPAGE连续蛋白上样缓冲液(5×)由Tris、溴酚蓝等组成，用于PAGE连续蛋白电泳

PAGE连续蛋白上样缓冲液(5×)

PAGE连续蛋白上样缓冲液(5×)使用说明：

1.在室温或不超过37℃的水浴中溶解SDS-PAGE上样缓冲液(5X)。水浴溶解后立即室温存放，尽量避免长时间置于水浴中。

2.按照每4微升蛋白样品加入1微升蛋白上样缓冲液(5X)的比例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液(5X)。

3.100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。

注意：如果起始时细胞或组织的用量较大，基因组DNA含量较高，煮沸3-5分钟后有可能仍然比较粘稠或者有粘稠状的半透明物体。此时需要再煮沸5-10分钟或者加入适量稀释成1X的蛋白上样缓冲液后再煮沸3-5分钟。充分煮沸后一方面可以使结合在基因组DNA上的蛋白充分释放，同时会导致基因组DNA的部分断裂从而使粘稠感消失，这样就不会影响后续的上样操作了。

4.冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。

5.通常电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

应用^[4-5]

PAGE连续蛋白上样缓冲液(5×)可以用于氢化镁调控PLIN2缓解结晶肾损伤的作用和机制研究

探讨氢化镁是否具有改善结晶肾模型肾损伤的程度及是否能够通过PLIN2发挥其改善作用。研究目的一、氢化镁改善草酸盐诱导的结晶肾损伤的作用研究二、氢化镁缓解结晶肾损伤的潜在靶点筛选三、氢化镁调控PLIN2缓解结晶肾损伤的机制研究。

研究方法一、动物模型的建立及分组动物实验一:购买36只雄性野生型C57B/L6小鼠(8周龄),随机分为6组,分别是盐水组(Con,n=6)、乙醛酸盐组(Gly,n=6)、乙醛酸盐+氢化镁50mg/Kg组(Gly+MH50,n=6)、乙醛酸盐+氢化镁100mg/Kg组(Gly+MH100,n=6)、乙醛酸盐+氢化镁200mg/Kg组(Gly+MH200,n=6)、乙醛酸盐+氢化镁400mg/Kg组(Gly+MH400,n=6)。动物实验二:另40只雄性C57BL/6小鼠(8周龄),随机分为5个实验组:盐水组(Con,n=8);乙醛酸诱导的草酸钙结晶组(Gly,n=8);乙醛酸+氢化镁组(GH,n=8);乙醛酸+氢氧化镁组(GOH,n=8);乙醛酸+玉米油组(GV,n=8)。

动物实验一:提前2天分别使用50、100、200、400 mg/kg剂量的Mg H2灌胃治疗。第3天给予乙醛酸盐腹腔注射造模,1天一次,连续注射5天,第8天处死小鼠。动物实验二:提前2天分别予氢化镁(200mg/kg)、氢氧化镁(450mg/kg)、玉米油0.1ml灌胃,第3天给予乙醛酸盐腹腔注射造模,1天一次,连续注射5天,第8天处死小鼠。

二、肾组织病理染色肾组织取材固定后,进行常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、烘片,按照实验步骤,进行H&E、Masson、Vonkossa、免疫组化、免疫荧光等染色,使用光学显微镜和荧光显微镜进行拍照。

三、小鼠肾功能及氧化应激指标的检测小鼠麻醉后,眼球取血、静置、离心、取上清,备用。采取竞争法酶联免疫吸附检测技术(ELISA),购买相应检测指标的Kit,根据实验步骤检测。

四、细胞培养、分组和干预使用小鼠肾小管上皮细胞(TCMK-1)作为体外实验细胞,配制DMEM培养基,在DMEM培养基中加入10%胎牛血清和1%双抗(青霉素-链霉素-两性霉素B溶液)。细胞实验分组:Con组:TCMK-1细胞,每天定时观察细胞状态、更换新鲜培养基未添加任何刺激;Na Ox组:加入草酸钠浓度(0.5m M)共孵育,在培养箱中培养24小时;Na Ox+H2组:加入草酸钠浓度(0.5m M)后放入含氢细胞培养箱12小时,12小时后取出放培养箱中继续培养。Con+H2组:TCMK-1细胞同样放入含氢细胞培养箱12小时,12小时后取出放培养箱中继续培养。

五、细胞活力检测使用CCK-8检测试剂盒检测,根据实验步骤,在96孔培养板中加入不同浓度的草酸钠,在培养箱中孵育不同的时间,另一个96孔板增加含氢培养,最后加入CCK-8溶液,利用酶标仪测定其在450nm处OD值。

六、细胞内ROS检测配制DCFH-DA至10umol/l,将收集好的细胞置于DCFH-DA中,放入细胞培养箱内20分钟取出,流式细胞仪检测DCF水平。

七、细胞线粒体膜电位的检测根据试剂盒的说明将CCCP(10m M)1:1000加入到细胞培养液中,配成终浓度10μM,孵育细胞20分钟,装载JC-1,通过流式细胞仪检测线粒体的膜电位。

八、组织与细胞蛋白检测利用总蛋白提取试剂提取组织或细胞蛋白,研磨、离心、取上清液,BCA法检测样品蛋白的浓度,加入PAGE连续蛋白上样缓冲液(5×),100℃金属浴,5-10min。-20℃冰箱保存,通过蛋白免疫印迹法检测进目的蛋白水平。

参考文献

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