不动杆菌属通用PCR试剂盒的应用

背景^[1-3]

不动杆菌属通用PCR试剂盒是一种用于检测和鉴定不动杆菌属细菌的试剂盒。它包含了PCR反应所需的所有试剂，如DNA聚合酶、dNTPs、引物等，以及一些辅助试剂，如缓冲液、染料等。

使用不动杆菌属通用PCR试剂盒进行PCR扩增时，需要设计针对不动杆菌属细菌的特异性引物。这些引物可以结合到不动杆菌属细菌的特定基因序列上，从而扩增出目标DNA片段。通过电泳分离和检测扩增产物，可以确定样品中是否存在不动杆菌属细菌。

不动杆菌属通用PCR试剂盒

不动杆菌属通用PCR试剂盒使用方法：

一、稀释PCR阳性对照

1.注意：由于阳性对照浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。

2.标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

3.用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液（最好用带芯枪头，下同）。

4.在7号管中加入5μL 1×10E8拷贝/μL的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

5.换枪头，在6号管中加入5μL 1×10E7拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，

充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

6.换枪头，在5号管中加入5μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

7.重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

8.如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），

一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL PCR阳性对照的10000倍稀释的（稀释后浓度为1×10E4拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝，可以将10μL原液加入到990μL自备TE溶液中，充分混匀，此为100倍稀释液。再取10μL此稀释液加入到990μL自备TE溶液中，充分混匀，此为10000倍稀释液）再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品DNA。

9.用自选方法纯化N+2个样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。

三、设置qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）

10.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第4号阳性对照稀释液，浓度为14810拷贝/μL）。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把6个标曲反应缩减成1个，其余不变。

四、数据处理

11.如果把不动杆菌属通用PCR试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品cDNA浓度的log值，再推算出其浓度。

应用^[4-5]

不动杆菌属通用PCR试剂盒可以用于不动杆菌属菌种鉴定及vgrGⅥ型分泌系统毒力效应研究

多重耐药鲍曼不动杆菌的感染控制通常需要全方面的应对措施,包括风险因素识别、微生物的准确鉴定、耐药菌株的快速检测和识别,并实施感染控制和预防策略。由于不动杆菌属各菌种类型较多,且属内部分菌种间差异小,其菌种鉴定及分类长期以来一直不理想,而基于表型鉴定、16SrRNA基因测序等传统方法难以将其准确鉴定到种,在实际临床应用中一直缺乏快速、准确的鉴定方法。

针对临床提出的现实问题,本研究选取2009年1月至2010年1月期间全国27个省市收集的2582株非重复不动杆菌属菌株,首先通过VITEC 2生化鉴定法和blaOxA-51-like基因进行菌种初步鉴定。其中385株blaOXA-51-like基因阴性菌和24株blaOxA-51-like基因阳性菌应用MALDI-TOF MS质谱进行二次鉴定,再通过16S rRNA基因与rpoB基因测序鉴定。由于公共数据库中暂缺相对完善与可靠的rpoB基因参考序列,本研究下载了全基因组序列截取rpoB基因作为参考。

研究结果表明,目前临床广泛应用的不动杆菌属通用PCR试剂盒鉴定、质谱都不足以准确鉴定不动杆菌属细菌,16SrRNA基因测序法也只能将不动杆菌属细菌准确鉴定到属。本研究设计的基于rpoB基因序列的鉴定方法克服了现有文献rpoB基因扩增片段过短、引物位置设计不一、相互之间无法比较、无鉴定标准等诸多缺陷,并根据现有数据提出rpoB基因序列相似度阈值为97%可作为界定不动杆菌属各菌种的分类新标准。

另外,本研究通过对rpoB基因序列系统发生树分析,发现一簇由11株临床菌株构成的独立分支,极可能代表了一个不动杆菌属新菌种,我们依照惯例将其按不动杆菌属基因型命名为A.genomic species 33YU。细菌Ⅵ型分泌系统(T6SS)负责捕捉原核生物和真核生物细胞,将有毒效应分子定位到靶细胞,从而杀死靶细胞。T6SS细胞器在功能上类似于收缩噬菌体的尾部,由VgrG长钉聚体蛋白复合物穿透、攻击靶细胞。

本研究通过敲除鲍曼不动杆菌ATCC17978、ATCC19606的vgrG基因明确T6SS元件在鲍曼不动杆菌生存能力、侵袭宿主细胞能力及调控相关耐药基因表达等方面的重要作用。研究结果表明。当敲除vgrG基因后,鲍曼不动杆菌的生长速度减慢,对细胞粘附能力降低,对小鼠的致死能力降低,但是生物被膜形成能力并无明显改变,提示vgrG基因在鲍曼不动杆菌的毒力形成中扮演重要角色,其毒力效应的改变并非通过生物被膜相关途径发挥效应。

另外,vgrG基因的敲除对其耐药机制也存在影响,vgrG基因敲除株对哌拉西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢哌酮/舒巴坦等药物产生耐药,对氯霉素和链霉素药物敏感性增加。

参考文献

[1]Virulence-related traits of epidemic Acinetobacter baumannii strains belonging to the international clonal lineagesⅠ-Ⅲand to the emerging genotypes ST25 and ST78.Giannouli M;Antunes LC;Marchetti V;Triassi M;Visca P;Zarrilli R.BMC infectious diseases.2013

[2]Community-versus healthcare-acquired bloodstream infections at Groote Schuur Hospital,Cape Town,South Africa.McKay R;Bamford C.South African medical journal=Suid-Afrikaanse tydskrif vir geneeskunde.2015

[3]Strain-level bacterial identification by Ce02-catalyzed MALDI-TOF MS fatty acid analysis and comparison to commercial protein-based methods.Hong SK;Park Y;Kim M;D''Souza R;Park ES;Yong D,et al.BioMed research international.2015

[4]Simplified phenotypic tests for identification of Acinetobacter spp.and their antimicrobial susceptibility status.Prashanth K;Badrinath S.Journal of medical microbiology.2000

[5]王建峰.不动杆菌属菌种鉴定及vgrGⅥ型分泌系统毒力效应研究[D].浙江大学,2018.