HS 695T人黑色素瘤贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

HS 695T人黑色素瘤贴壁细胞系是一种来源于人类黑色素瘤的细胞系。它最初是由美国国立癌症研究所(NCI)于1970年代从一名患有黑色素瘤的患者体内分离出来的。

HS 695T人黑色素瘤贴壁细胞系

HS 695T人黑色素瘤贴壁细胞系的特点包括：

贴壁生长：HS 695T细胞系可以在含有血清的培养基中贴壁生长，形成单层或多层的细胞群落。

异质性：HS 695T细胞系具有较高的异质性，即不同克隆的细胞在形态、生长速度和基因表达等方面存在差异。

耐药性：HS 695T细胞系对多种化疗药物具有耐药性，这使得它成为研究黑色素瘤耐药机制的重要工具。

基因突变：HS 695T细胞系中存在多个已知的致癌基因突变，如BRAF、NRAS等。这些突变可能与该细胞系的恶性转化有关。

一．HS 695T人黑色素瘤贴壁细胞系培养基及培养冻存条件准备：

1）准备1640（推荐YJ-0002）培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．HS 695T人黑色素瘤贴壁细胞系细胞处理：

1）冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）HS 695T人黑色素瘤贴壁细胞系细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

1.细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.

2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3.将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

应用^[4-5]

HS 695T人黑色素瘤贴壁细胞系可以用于TRIM28对肿瘤睾丸抗原HCA587/MAGEC2转录后的调控作用

HCA587/MAGEC2是肿瘤睾丸抗原,在正常组织中仅表达于睾丸,然而在多种肿瘤组织中异常表达。目前研究发现,在多种类型肿瘤中,HCA587/MAGEC2的表达与不良预后相关,且已有越来越多的证据表明MAGEC2在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。迄今为止,对于MAGEC2表达调控方面的研究甚少,我们发现与HCA587/MAGEC2结合的TRIM28(又称为KAP-1,TIF1)对HCA587/MAGEC2的表达具有调控作用。

目的:研究TRIM28对HCA587/MAGEC2表达的调控作用及其机制。

方法:用小干扰RNA特异下调内源性表达HCA587/MAGEC2的人黑色素瘤细胞系A375和HS 695T人黑色素瘤贴壁细胞系中TRIM28的表达,利用实时定量PCR和Western blot方法,在mRNA和蛋白水平检测TRIM28下调后,MAGE-C2的mRNA和蛋白水平的表达情况。在A375和HS 695T人黑色素瘤贴壁细胞系细胞中敲低TRIM28后,用蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂氯喹两种药物分别处理细胞,观察这两种细胞中肿瘤睾丸抗原MAGE-C2的蛋白水平变化;用放线菌酮CHX药物处理细胞,观察MAGEC2的蛋白降解速率与对照组相比,是否发生变化。

将HCA587/MAGEC2基因的5’和3’非编码区分别克隆到萤光素酶报告基因载体,转染A375和Hs 695T细胞后观察敲低TRIM28后萤光素酶的活性。利用免疫组织化学染色的方法检测TRIM28和MAGEC2在原发性肝细胞癌组织中的表达。

结果:在人黑色素瘤细胞系A375和HS 695T人黑色素瘤贴壁细胞系中,特异下调TRIM28的表达后,可看到HCA587/MAGEC2蛋白水平显著降低,但HCA587/MAGEC2mRNA水平无明显变化;用MG132或氯喹处理后,MAGEC22蛋白水平并没有明显回升。用CHX药物处理后,TRIM28敲低组与对照组相比,MAGE-C2的降解速率没有明显变化。萤光素酶活性分析提示TRIM28对HCA587/MAGEC2蛋白水平的调控主要作用于HCA587/MAGEC2基因的3’非编码区。肝癌组织标本的分析显示TRIM28和HCA587/MAGEC2蛋白的表达呈显著正相关。

结论:TRIM28可通过转录后的调控机制对肿瘤睾丸抗原HCA587/MAGEC2在肿瘤细胞内的表达水平起调控作用,但并不依赖于蛋白酶体降解途径。

参考文献

[1]A Penicillin Derivative Exerts an Anti-Metastatic Activity in Melanoma Cells Through the Downregulation of Integrinαvβ3 and Wnt/β-Catenin Pathway..Barrionuevo Elizabeth;;Cayrol Florencia;;Cremaschi Graciela A;;Cornier Patricia G;;Boggián Dora B;;Delpiccolo Carina M L;;Mata Ernesto G;;Roguin Leonor P;;Blank Viviana C.Frontiers in pharmacology,2020

[2]Expression of LGR5,FZD7,TROY,and MIST1 in Perioperatively Treated Gastric Carcinomas and Correlation with Therapy Response..Freiin Grote Antonia;;Halske Christine;;Behrens Hans-Michael;;Krüger Sandra;;Wilhelm Franziska;;Egberts Jan-Hendrik;;Röcken Christoph.Disease markers,2019

[3]Trim28 contributes to EMT via regulation of E-cadherin and N-cadherin in lung cancer cell lines..Lu Chen;;Teresita Muñoz-Antonia;;W Douglas Cress.PLoS ONE,2017

[4]E-cadherin:A potential biomarker of colorectal cancer prognosis..Christou Niki;;Perraud Aurélie;;Blondy Sabrina;;Jauberteau Marie-Odile;;Battu Serge;;Mathonnet Muriel.Oncology letters,2017

[5]李宜儒.MIST1在人类黑色素瘤中与失巢凋亡的关系作用及机制研究[D].安徽医科大学,2022.