人神经胶质瘤细胞的应用

背景^[1-3]

人神经胶质瘤细胞是一种来源于神经系统的恶性肿瘤细胞，通常在脑组织中发生。它们具有高度异质性和侵袭性，能够快速增殖并扩散到周围组织和器官。

人神经胶质瘤细胞可以分为多种类型，包括星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、髓母细胞瘤等。这些类型的肿瘤细胞在形态学上有所不同，但都具有恶性生长的特征。

人神经胶质瘤细胞的生长受到多种因素的影响，包括基因突变、环境因素、免疫系统等。目前尚无完全治愈人神经胶质瘤的方法，治疗主要是通过手术切除、放疗和化疗等方式来控制肿瘤的生长和扩散。

人神经胶质瘤细胞

一．人神经胶质瘤细胞培养基及培养冻存条件准备：

1）准备1640（推荐YJ-0002）培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．人神经胶质瘤细胞处理：

1）冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）人神经胶质瘤细胞细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

1.细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.

2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3.将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

应用^[4-5]

人神经胶质瘤细胞可以用于FePt纳米粒子诱导人神经胶质瘤细胞凋亡的机制研究

神经胶质瘤是具有极高死亡率的一种高度恶性脑肿瘤,它的一般治疗方法包括外科手术切除,纳米粒子做药物放化疗等。FePt纳米粒子具有优异的超顺磁性,目前,已被用作MRI造影剂用于检测肿瘤细胞。在之前的有关FePt纳米粒子的研究中,我们合成出表面有油胺-油酸包被的FePt纳米粒子,并将FePt纳米粒子与U251细胞共培养后通过MTT检测检测细胞的存活率,实验已经证实FePt纳米粒子可以抑制U251细胞的增殖,然而具体作用机理尚未明确。因此,本研究旨在探讨FePt纳米粒子诱导U251细胞凋亡的作用及机制研究。

本文首先通过TEM对FePt纳米粒子进行分散性和粒径分布的表征,结果显示,FePt纳米粒子分散性较好,且粒径较为均一,在10 nm以下。然后通过CCK-8试剂盒检测了0.1、1、5、25和75μg/m L的FePt纳米粒子与U251细胞共培养6、12、24、48和72 h后,细胞存活率的变化;通过LDH释放试剂盒检测了共培养后细胞膜完整性的变化;通过Hoechst-PI双重染色以及流式细胞术检测细胞凋亡定性定量观察了共培养后U251细胞的凋亡情况。

结果表明,FePt纳米粒子能显著诱导U251细胞凋亡,且不同浓度FePt纳米粒子与U251细胞作用不同时间后,U251细胞的凋亡状况明显不同,当作用时间较短时,高浓度FePt纳米粒子诱导U251细胞凋亡更为显著,其中,5μg/m L FePt纳米粒子与U251细胞培养24 h时,细胞凋亡程度最为显著,同时随着培养时间延长,低浓度FePt纳米粒子对U251细胞增殖的抑制作用逐渐显现。

接着,本文通过流式细胞术检测了FePt纳米粒子对U251细胞周期阻滞情况;通过各氧化应激酶(SOD,CAT,GPx)以及氧化损伤产物(MDA)检测试剂盒检测了细胞内氧化应激状态的变化。通过蛋白免疫印迹检测了与细胞凋亡相关蛋白p53,Bcl-2,Bax表达水平的变化。

结果表明,U251用FePt纳米粒子处理后,U251细胞周期大多被阻滞在G0/G1期,S期和G2/M期细胞数目下调,同时,U251细胞中SOD,CAT,GPx活性均不同程度的下降,MDA含量增多,细胞质中ROS大量累积,抑癌基因p53表达减少,导致抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少,促凋亡蛋白Bax表达变多,细胞凋亡增多,即在分子水平上证明了FePt纳米粒子进入细胞后,通过调制细胞周期,损伤DNA、线粒体的内凋亡途径诱导U251细胞凋亡。

参考文献

[1]Haloperidol Induced Cell Cycle Arrest and Apoptosis in Glioblastoma Cells..Papadopoulos Fotios;Isihou Rafaela;Alexiou George A;Tsalios Thomas;Vartholomatos Evrysthenis;Markopoulos Georgios S;Sioka Chrissa;Tsekeris Pericles;Kyritsis Athanasios P;Galani Vasiliki.Biomedicines,2020

[2]Inhibition of Glioma Cell Growth and Apoptosis Induction through Targeting Wnt10B Expression by Pyrazolo[4,3-c]pyridine-4-one.Liu Yang;Yaozu Zhu;Zhao Huang;Peng Peng;Tingbao Zhang;Jincao Chen.Medical Science Monitor,2020

[3]Endocytosis:The Nanoparticle and Submicron Nanocompounds Gateway into the Cell.Darío Manzanares;;Valentín Ceña.Pharmaceutics,2020

[4]Crocin has pharmacological effects against the pathological behavior of colon cancer cells by interacting with the STAT3 signaling pathway..Wang Jun;;Ke Yupei;;Shu Tao.Experimental and therapeutic medicine,2020

[5]黎瑶敏.FePt纳米粒子诱导人神经胶质瘤细胞凋亡的机制研究[D].武汉理工大学,2023.