重组肠激酶的制备

背景及概述^[1]

肠激酶( Enterokinase，EK，EC3.4.21.9) 是一种异源二聚体形式存在于哺乳动物十二指肠内的丝氨酸蛋白酶。它能高效专一性的水解工程菌表达的融合蛋白（识别位点 是Asp-Asp-Asp-Asp-Lys）释放出目的蛋白，被广泛用于生物工程制药的开发。牛肠激酶由 一条结构亚基（重链）和一条催化亚基（轻链）构成，二者以二硫键结合。据报道，重组肠激酶轻链体外具有全酶的酶切特异性，同时对基因工程融合蛋白底物的酶切活性较提纯的牛肠激酶明显增强。天然肠激酶来源有限，且从动物组织提取的肠激酶易污染其他蛋白，给实际应用带来了困难。这就要求用基因工程方法生产高纯度的肠激酶。重组肠激酶可以切割含有四个天冬氨酸的赖氨酸羧基端肽键：天冬氨酸 - 天冬氨酸 - 天冬氨酸 - 天冬氨酸 - 赖氨酸（DDDDK）。可以在较宽pH范围（4.5-9.5）和较宽温度范围内有效切割融合蛋白。重组肠激酶可去除位于蛋白质N-末端的融合蛋白，以除去不需要的融合标签。

产品特性

单位定义：1U定义为在25℃，12h~16h之内，将0.5mg保存于25mM Tris-HCl 8.0 缓冲液中的融合蛋白切割95%所需的酶量。

推荐使用方法

1）25℃酶切条件：

按照酶活性定义，酶切条件举例：

25mM Tris-HCl 8.0体系中：

融合蛋白  0.1-1mg/ml（蛋白总量50-100µg）

重组EK   0.1-0.2U

25℃过夜酶切，或完全酶切需16-24h，用SDS-PAGE检测酶切效果。

2）4℃低温酶切条件：

4℃能对底物进行有效酶切，但需要将酶切时间延长至48-64h，或增加2-3倍酶量。

3）酶切优化和放大

优化：可以对酶切条件进行优化，例如缓冲液pH，融合蛋白浓度，EK的量，以及酶切时间，使融合蛋白能在稳定条件下被酶切，用SDS-PAGE检测酶切效果。

放大：选择优化后的反应条件，按该条件等比例放大，用SDS-PAGE检测酶切效果。

4）去除重组肠激酶的方法：使用胰蛋白酶抑制剂亲和层析（例如sigma T0637）去除重组肠激酶。

5）注意：不建议37℃条件下酶切，可能会有非特异性酶切出现。

常见影响肠激酶活性的因素

在＞200mM 咪唑，或＞200mMNaCl，或＞5%甘油，酶切效果受影响。可参照以下推荐方法进行酶切：

1）为获得理想酶切结果，请将样品透析到25mM Tris-HCl 8.0缓冲液中，再进行酶切。

2）若不便透析，可将样品稀释，咪唑含量在100mM以下，NaCl浓度在50mM以下，甘油浓度小于5%以下进行酶切，酶的用量与蛋白的比例不变（即1U酶切500µg蛋白）。

3）如果样品溶液中含有上述成分中的一种或多种，且不便去除，此时适当增加酶量或延长酶切时间，也可达到较好酶切效果。

储存和运输稳定性

酶液储存稳定性：-20℃，24个月稳定；25℃，一周内，无活性损失。缓冲体系：50mM Tris-HCl，pH8.0，250mM NaCl，2mMCa2+，50%甘油。

酶液反复冻融稳定性：反复冻融5次，无活性损失。

运输稳定性：蓝冰保温运输，稳定。

制备^[1]

一种制备重组肠激酶的方法，该方法包括：

（1）重组表达融合蛋白，所述融合蛋白序列从N端到C端依次包括：100-250个氨基酸序列、肠激酶序列；

（2）切除融合蛋白N端所述的100-250个氨基酸序列获得重组肠激酶，所述重组肠激酶的氨基酸序列为Seq ID No.1，核苷酸序列为Seq ID No.4。

主要参考文献

[1] CN201611258115.6 一种重组肠激酶的制备方法