CAPAN-2人胰腺癌贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

CAPAN-2人胰腺癌贴壁细胞系是一种来源于人类胰腺癌的贴壁细胞系。这些细胞系是通过将胰腺癌组织样本移植到实验室培养皿中，并使用特定的生长条件和培养基来分离和培养的。

CAPAN-2人胰腺癌贴壁细胞系通常用于研究胰腺癌的发生、发展和治疗。这些细胞系可以提供一个体外模型，用于评估新的抗癌药物的疗效，以及研究肿瘤细胞的生物学特性和分子机制。

在临床实践中，医生可能会使用CAPAN-2人胰腺癌贴壁细胞系进行诊断和治疗决策。例如，通过分析这些细胞系的基因表达谱，可以帮助确定患者的癌症类型和分级，从而指导个体化的治疗方案。此外，研究人员还可以利用这些细胞系进行药物筛选和毒性测试，以寻找新的抗癌药物或治疗方法。

CAPAN-2人胰腺癌贴壁细胞系

一．CAPAN-2人胰腺癌贴壁细胞系培养基及培养冻存条件准备：

1）准备1640（推荐YJ-0002）培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．CAPAN-2人胰腺癌贴壁细胞系细胞处理：

1）冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）CAPAN-2人胰腺癌贴壁细胞系细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

1.细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.

2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3.将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

应用^[4-5]

CAPAN-2人胰腺癌贴壁细胞系可以用于KRT18增强c-Myc通路促进胰腺癌增殖、侵袭、转移的分子机制研究

收集36对未经放化疗的新鲜胰腺癌及癌旁组织样本,通过Western blot实验和免疫组化实验检测本研究中KRT18的表达量。在胰腺正常细胞HPNE和4种胰腺癌细胞As PC-1、CAPAN-2人胰腺癌贴壁细胞系、PANC-1、SW1990中通过q PCR实验和Western blot实验检测KRT18基因m RNA和蛋白表达水平。为进一步研究KRT18对胰腺癌细胞恶性表型的影响。

本研究使用si RNA(si KRT18-1、si KRT18-2、si KRT18-3)分别转染As PC-1细胞和CAPAN-2人胰腺癌贴壁细胞系细胞。通过q PCR和Western blot实验检测si KRT18-1、si KRT18-2、si KRT18-3在As PC-1细胞和CAPAN-2人胰腺癌贴壁细胞系细胞中的敲减效率。为了明确KRT18对胰腺癌细胞增殖的影响,我们首先观察在细胞转染了KRT18 sh RNA后的CCK-8实验和克隆形成实验的变化。

为了明确KRT18对胰腺癌细胞迁移的影响,我们观察在细胞转染了KRT18 sh RNA后的伤口愈合实验的变化。为了明确KRT18对胰腺癌细胞侵袭的影响,我们观察在细胞转染了KRT18 sh RNA后的Transwell实验的变化。EMT通路是在癌细胞中发挥着促进肿瘤转移作用最显著和最重要的通路之一。

为了确认KRT18是否通过调控EMT信号通路的活化影响As PC-1和CAPAN-2人胰腺癌贴壁细胞系细胞转移。我们通过Western blot检测各组KRT18、E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、波形蛋白及Snail的蛋白表达水平。由于在第一部分的研究中,我们发现c-Myc通路在高代谢亚型中明显激活,而且c-Myc通路是在癌细胞中发挥着促癌作用最显著和最重要的通路之一。可影响细胞的增殖、细胞周期、凋亡等多种过程。

为了进一步确认KRT18是否通过调控c-Myc信号通路的活化影响As PC-1和CAPAN-2人胰腺癌贴壁细胞系细胞转移。我们通过Western blot检测各组KRT18和c-Myc的蛋白表达水平。最后,为了进一步确定KRT18促进胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和转移是否通过c-Myc通路介导。首先过表达KRT18,然后检测c-Myc通路是否激活以及增殖、迁移、侵袭的表型是否被促进,最后通过c-Myc通路抑制剂检查这些被促进的过程是否得到有效回复。通过这样的rescue回复实验,检验c-Myc通路是否可以介导KRT18的功能。为了进一步明确其在胰腺癌细胞中的作用,我们通过构建10只裸鼠胰腺癌移植瘤动物模型,在体内探究KRT18对胰腺癌肿瘤的生长作用。Western blot实验和IHC实验检测不同模型分组组织中KRT18的表达量。

参考文献

[1] Decreased miR-940 expression can predict a negative prognosis in early-stage nonsmoking female lung adenocarcinoma..Ma Qianli;Zhang Jin;Huang Jingjing;Wang Xiaowei;Xiao Fei;Xing Huajie;Wang Ye;Guo Yongqing;Shi Bin;Song Zhiyi;Liu Deruo;Si Chaozeng;Horinouchi Hidehito;Liang Chaoyang.Translational lung cancer research,2021

[2]Total Keratin-18(M65)as a Potential,Early,Non-Invasive Biomarker of Hepatocyte Injury in Alcohol Intoxicated Adolescents—A Preliminary Study.Zdanowicz Katarzyna;Olanski Witold;KowalczukKryston Monika;BobrusChociej Anna;Werpachowska Irena;Lebensztejn Dariusz Marek.Biomolecules,2021

[3]Diagnostic and prognostic impact of cytokeratin 18 expression in human tumors:a tissue microarray study on 11,952 tumors..Menz Anne;Weitbrecht Timo;Gorbokon Natalia;Büscheck Franziska;Luebke Andreas M;Kluth Martina;HubeMagg Claudia;Hinsch Andrea;Höflmayer Doris;Weidemann Sören;Fraune Christoph;Möller Katharina;Bernreuther Christian;Lebok Patrick;Clauditz Till;Sauter Guido;Uhlig Ria;Wilczak Waldemar;Steurer Stefan;Minner Sarah;Burandt Eike;Krech Rainer;Dum David;Krech Till;Marx Andreas;Simon Ronald.Molecular medicine(Cambridge,Mass.),2021

[4]Global Cancer Statistics 2020:GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries.Sung Hyuna;Ferlay Jacques;Siegel Rebecca L.;Laversanne Mathieu;Soerjomataram Isabelle;Jemal Ahmedin;Bray Freddie.CA:A Cancer Journal for Clinicians,2021

[5]高杨.KRT18增强c-Myc通路促进胰腺癌增殖、侵袭、转移的分子机制研究[D].中国医科大学,2023.