N1-甲基-假尿苷在修饰mRNA疫苗中的应用

发布日期:2023/10/25 15:35:07

N1-甲基-假尿苷，英文为1-methylpseudouridine，常温常压下为固体，不溶于水。N1-甲基-假尿苷是一种甲基化的假尿苷衍生物，主要用作生物化学试剂，可用来降低外源合成mRNA的免疫原性，同时提升抗原翻译效率，在新冠mRNA疫苗的研发和生产中有一定的应用。

N1-甲基-假尿苷的化学结构式

图1 N1-甲基-假尿苷的化学结构式

背景介绍

Kariko以及合成者数十年来在mRNA领域的积累带来重大的突破性成果：在人类RNA中发现的许多化学修饰可以减弱免疫刺激，如假尿嘧（Pseudouracil）、硫代尿苷（thiouridine）、甲基胞嘧啶（methylcytosine）。后来人们证明这些化学修饰核苷酸可以提升mRNA蛋白表达效率，这也催生了N1-甲基-假尿苷在RNA合成中的应用，研究人员发现N1-甲基-假尿苷修饰RNA既可以提升蛋白表达量，还能够降低TLR3的激活。

实验研究

为将翻译过程和免疫反应激活剥离分析，Svitkin等人利用无细胞翻译系统来研究N1-甲基-假尿苷修饰RNA的翻译效果。他们发现N1-甲基-假尿嘧啶的插入可以提升附着在mRNA上多聚核糖体的丰度和尺寸，由此推断更多的翻译起始和更缓慢的延伸速度可能协同提升mRNA的半衰期，同时引发mRNA与核糖体更加富有成效的相互则作用。这些研究首次证实N1-甲基-假尿嘧啶修饰RNA能够直接影响mRNA翻译效率的。RNA的天然修饰对于翻译表达效率的影响是有背景依赖的，换句话说，对于不同的RNA，化学修饰施加的影响是不同的，另外，这些效应也取决于修饰核苷酸在RNA序列中所处位置，例如CDS序列或UTR序列。Sample等人对多聚核糖体进行RNA测序，以求了解携带280000个不同5'UTR序列的尿嘧啶RNA和N1-甲基-假尿苷RNA是如何装填核糖体的。他们发现，核糖体的载量同mRNA预测自由能成负相关性，即结构化的5'UTR抑制翻译。然而，这种负相关在N1-甲基-假尿苷RNA上比尿嘧啶RNA体现更加明显，这表明，对于5'UTR序列来说，通过修饰碱基稳定结构可能会减少蛋白表达。与此相反，还有研究表明N1-甲基-假尿苷修饰能够稳定CDS序列中的二级结构，从而提升mRNA翻译功能性半衰期。上述研究表面N1-甲基-假尿嘧啶对于提升蛋白产量来说并不是灵丹妙药。对于大多数mRNA序列来说，N1-甲基-假尿嘧啶化学修饰同尿嘧啶具有相似或更好的翻译表达效率，但在某些情况下，这种化学修饰只会带来更糟糕的翻译表达效率。[2]

制备mRNA疫苗

mRNA技术在疫苗或者蛋白替代疗法领域的应用，面领着一个巨大的挑战：外源合成mRNA;识别双链RNA或者5'末端携带三磷酸修饰的RNA。尽管免疫反应的触发对于疫苗理论上来说是有利的，但不受控制的免疫反应将导致过敏反应和免疫休克。人们早已证实T7RNA聚合酶可以将假尿嘧啶插入到mRNA中，在BNT162B2序列中，所有的尿嘧啶核苷酸全部被N1-甲基-假尿苷所替换，修饰核苷酸与mRNA所有功能元件如SDS区域等兼容性高，能够正常起始转录和蛋白翻译，因此这种修饰核苷酸的替换，在治疗性mRNA的临床实际应用效果是非常显著的。[1]

降低RNA免疫原性机制

N1-甲基-假尿苷修饰RNA降低免疫原性存3种机制，这些机制还没有被彻底阐明，修饰核苷酸对于mRNA免疫原性的影响，可能是通过以下一种或联合发挥作用。1. 减少反义RNA链合成：在高产量合成条件下，T7RNA聚合酶有时会以合成出来的RNA为模板，合成出少量的反义RNA链，从而形成dsRNA，除去这些dsRNA可以减弱免疫原性。此外，有研究发现使用修饰碱基核苷酸能够合成不需要纯化的非免疫刺激性的mRNA。以上研究说明在RNA合成过程中，使用化学修饰核苷酸可能有助于减弱dsRNA的形成。2. 改变RNA二级机构：除反义RNA链杂质，mRNA还会形成能够被细胞内模式识别受体识别的例如TLR3的二级结构。有研究发现，含有N1-甲基-假尿苷的RNA与含尿嘧啶的RNA具有不同的二级结构，修饰核苷酸还被发现能够减弱外源mRNA放大RIG-I免疫信号途径的功能，这说明修饰核苷酸可能对蛋白-RNA之间相互作用造成影响，因此在RNA序列中插入修饰核苷酸极有可能改变RNA二级结构或蛋白/RNA二级结构相互作用，减弱识别事件。3. 改变与单链RNA识别受体的相互作用：在免疫细胞中，单链多聚尿嘧啶核苷酸能够被TLR7识别，是免疫细胞合成干扰素的最强诱导因子之一。为确认N1-甲基-假尿苷是否会改变单链RNA的免疫识别，最新有研究评估了含有N1-甲基-假尿苷RNA激活炎症基因表达的水平。为消除由于dsRNA引起的差异，研究人员在小鼠模型将识别dsRNA的相关免疫反应途径沉默掉。即便在缺乏dsRNA识别信号途径的情况下，N1-甲基-假尿苷RNA依然要比尿嘧啶RNA具有更弱的免疫原性。这说明N1-甲基-假尿苷在空间位置呈现的位阻可能阻断免疫识别受体和外源合成RNA中单链部分的相互作用。

应用

N1-甲基-假尿苷主要用作生物核苷酸修饰剂，以提升mRNA蛋白表达效率。N1-甲基-假尿苷可以降低外源合成mRNA的翻译效率：mRNA药物的最终目的是在细胞内表达出治疗性蛋白。研发人员开始探索化学修饰核苷酸是否有助于提升mRNA蛋白翻译效率。在最初报道N1-甲基-假尿嘧修饰RNA可以提升蛋白表达水平的研究中发现这种助益部分原因是由于N1-甲基-假尿苷修饰RNA减弱TLR3的激活反应造成的。