RNA pulldown试剂盒

背景^[1-6]

RNA pulldown试剂盒是利用T4 RNA连接酶将单个脱硫生物素化的胞苷二磷酸连接到单链RNA的3’端。3’端的末端标记不干扰RNA结构，因此，该生物素标记不会影响RNA与蛋白的互相作用。每一次反应需要50pmol RNA。孵育时间的延长，以及在标记反应中加入DMSO，可优化RNA的标记效率。RRNA结合蛋白(RBPs)在转录后水平调节基因的表达起着重要的作用，具体的作用包括mRNA前体的剪接、多腺苷化和稳定性的维持，mRNA从细胞核向细胞质的运输，mRNA的定位和翻译等。

RBPs在这些过程中的调节作用是通过结合新合成的或者成熟后的转录物的特定序列实现的。于此同时，有很多RBPs能够识别RNA中的特定核苷酸序列。为了研究RNA与蛋白的相互作用建立了很多方法，这些方法包括EMSA、SELEX技术、RNA footprinting、RNA免疫沉淀(RIP)和RNA pulldown技术。RNA pulldown技术利用脱末端标记的RNA高效富集及鉴定RNA结合蛋白(RBPs)。

此方法避免了抗体的使用，大大延伸了使用范围。随着RNA pulldown技术的不断完善，其在生命科学研究及医学领域中扮演的角色愈加重要。NA pull-down实验就是先将RNA进行标记（如生物素探针标记），再与细胞裂解液共同孵育，从而形成RNA-蛋白质复合物，之后再分离复合物得到蛋白质，通过western blot 或mass Spectrometry检测蛋白质的技术。

目前RNA pull-down技术已成为研究miRNA、lncRNA与相互作用蛋白的主要技术手段之一。现如今的研究中，RNA pulldown研究的探针主要是合成生物素标记的单链探针，拓展了RNA的研究范围。Tsai等通过改进的RNA pulldown技术分析了长链非编码RNA(lincRNA)调节染色体状态和表观遗传。他们发现lincRNA HOTAIR作为至少两个组蛋白修饰复合体的脚手架。HOTAIR的5’端结合多梳抑制复合体2(PRC2)，3’端结合LSD1/CoREST/REST复合体，完成RNA介导的RPC2和LSD1复合体的组装从而完成H3K27和H3K4两个位点的甲基化。

RNA pulldown试剂盒使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过western blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。蛋白质与RNA的相互作用是许多细胞功能的核心，如蛋白质合成、mRNA组装、病毒复制、细胞发育调控等。若待检测目的蛋白明确，选择Western blot鉴定；若不明确，则可选择质谱鉴定。

缺点：(1)实验中使用到的珠子(琼脂糖珠子或磁珠)与蛋白的非特异结合，容易造成实验结果的假阳性；(2)RNA探针与蛋白结合的特异性不高；(3)实验过程还会受到核酸酶污染的影响。

应用^[7]

RNA pulldown试剂盒可用于LncRNA-miRNA-mRNA相互作用的研究：

非编码RNA依照其长度的不同可分为短链非编码RNA、中等长度非编码RNA以及长链非编码RNA(Long no-coding RNA,LncRNA)。短链非编码RNA长度小于50 nt,中等长度非编码RNA长度介于50-200 nt,而长非编码RNA长度大于200 nt。而且近年来研究表明,不同长度的RNA之间存在相互作用,特别是LncRNA与miRNA、miRNA与mRNA、lncRNA与mRNA都存在相互调节的关系,形成了lncRNA-miRNA-mRNA的相互调控网络,理清这一复杂而精细的调控网络,对于揭示RNA分子间的相互作用及阐释其功能至关重要。

参考文献

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