尿嘧啶DNA糖基酶的用途

背景及概述^[1]

尿嘧啶DNA糖基酶（Uracil-DNA Glycosylase ，UDG）来源于大肠杆菌重组克隆表达。分子量为25kDa，水解尿嘧啶和糖基之间的 N-糖基键，在含尿嘧啶的单链或双链 DNA 中产生脱嘧啶的位点，可催化含尿嘧啶的单链和双链DNA释放游离尿嘧啶。它对RNA无活性，主要应用于防止PCR扩增产物的污染。如将PCR核酸扩增的高灵敏度和胶体金免疫层析技术快速、简便、直观的优点结合起来，建立了同时检测2种对虾病毒(WSSV和IHHNV)的同步PCR-胶体金免疫层析检测方法，在PCR过程中使用UNG(尿嘧啶-DNA糖基酶)，极大地控制了遗留污染。该酶作用机理为：在PCR反应中以dUTP代替dTTP，扩增产物片段中的T全部被U取代，形成了含dU碱基的PCR扩增产物。UNG酶能选择性断裂单链和双链DNA中U碱基的糖苷键，降解反应体系中含U的DNA，有效消除PCR产物的残留污染，大大降低扩增产物污染导致的假阳性，从而保证扩增的特异性和准确性。

单位定义^[1]

在 37°C，60 分钟内从含有尿嘧啶的 DNA 模板中释放 1 nmol 尿嘧啶所需要的酶量定义为 1 U。

10×Reaction Buffer

200 mM Tris-HCl (pH 8.2， 25°C)， 10 mM EDTA， 100 mM NaCl.

保存缓冲液^[1]

30 mM HEPES-KOH (pH7.5)， 150 mM NaCl， 1 mM EDTA， 1 mM DTT， 0.05% (v/v) Tween 20， 50% (v/v) 甘油。

质量控制^[1]

无内切或外切脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、磷酸酶污染。

用途^[1]

PCR 交叉污染控制；

糖激酶介导的单核苷酸多态性检测(GMPD)；

位点特异性突变；

蛋白-DNA 相关作用研究用探针；

SNP 基因分型；

PCR 产物克隆；

PCR 产物和 cDNA 中产生单链突出末端。

抑制和失活

抑制剂：Baccillus subtilis 噬菌体 PBS2 来源的 Ugi 蛋白；Baccillus subtilis 噬菌体 phi29来源的 p56 蛋白。

失活：95°C 加热 10 分钟。当温度低于 55°C时，酶活性部分还原。因此 PCR 扩增后，PCR 产物冰浴后可直接上样凝胶电泳。

备注

Uracil-DNA Glycosylase在DNA中产生无碱基位点，加热、碱处理、内切核酸酶（特异性切割无碱基位点）可在该无碱基位点切割。UDG 发挥活性不受二价阳离子影响。

主要参考文献

[1] 丁东, 熊云, 方勇新, 等. WSSV 和 IHHNV 对虾病毒的胶体金免疫层析快速检测[J]. 水产养殖, 2014, 35(10): 1-7.