NALM-6 人急性B淋巴白血病细胞系的应用

背景^[1-3]

NALM-6人急性B淋巴白血病细胞系由19岁患有急性淋巴细胞白血病(ALL)的19岁男子的外周血建立，在1976年复发。该细胞CD24阳性，可与CD24阴性细胞N6/ADR成对，用于CD24的功能研究。

NALM-6人急性B淋巴白血病细胞系

NALM-6人急性B淋巴白血病细胞系细胞培养方法：

1、NALM-6人急性B淋巴白血病细胞系细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、NALM-6人急性B淋巴白血病细胞系细胞复苏：

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

3、NALM-6人急性B淋巴白血病细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；

④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

应用^[4-5]

NALM-6人急性B淋巴白血病细胞系可以用于5-Aza-CdR对B-ALL细胞系NALM-6的作用及其对miRNA影响的研究

背景B系急性淋巴细胞白血病（ALL）是儿童最常见的恶性肿瘤，近年来儿童ALL的长期无事件生存率已达到70%-80%，但确切的分子机制仍不清楚。许多研究表明，人类DNA异常甲基化和miRNA异常表达是肿瘤发生的一个共同特征。

抑癌基因启动子区过度甲基化导致了其表达水平降低或沉默，诱导细胞发生癌变。miRNA可降解靶基因mRNA或抑制其翻译，广泛地抑制靶基因的表达和抑制靶蛋白的翻译，从而参与调控细胞凋亡、增殖及分化等生命活动。

5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）是DNA甲基转移酶的抑制剂，本研究利用5-Aza-CdR处理B-ALL细胞系NALM-6，以降低细胞整体DNA甲基化水平，在此基础上探讨miRNA的改变。以期为B-ALL发生过程中DNA甲基化与miRNA的相关性提供理论基础，为后续治疗提供新的思路。

研究目的1、探索5-Aza-CdR对NALM-6细胞增殖、细胞凋亡的影响，以及对细胞中Dnmts表达水平的影响。

2、筛查NALM-6细胞去甲基化作用下表达量发生改变的miRNA；

3、预测发生改变的miRNA靶基因。

研究方法1、MTT法检测不同浓度5-Aza-CdR作用不同时间对NALM-6细胞增殖的作用。流式细胞术检测不同浓度5-Aza-CdR对细胞凋亡的影响。采用荧光定量RT-PCR检测5-Aza-CdR处理后细胞Dnmts基因mRNA表达水平变化。

2、采用miScript miRNA PCR Array芯片检测去甲基化后细胞中表达量发生改变的miRNA。

3、通过PicTar、TargetScan、MiRDB和miRTarBase4种软件预测发生改变的miRNA靶基因。

结果1、NALM-6细胞经不同浓度5-Aza-CdR处理不同时间后，细胞生长受抑，并出现早期凋亡，当浓度加大时，早期凋亡减少，晚期凋亡或死亡数增加。

2、5-Aza-CdR作用浓度与Dnmts基因mRNA表达水平呈反比。

3、miScript miRNA PCR Array筛出3个miRNA（miR-184，miR-23a-3p，miR-34a-5p）与DNA甲基化相关。

4、软件预测得到9个上述miRNA的靶基因。

结论1、5-Aza-CdR能够抑制B-ALL细胞NALM-6的增殖，促进该细胞早期凋亡。

2、5-Aza-CdR通过下调Dnmts基因表达发挥去甲基化作用。

3、miR-184，miR-23a-3p和miR-34a-5p在B-ALL的发生发展中与DNA甲基化相关。

4、CXCL12，POU4F2，IL6R，PDGFRA，MAP2K1，FOXP1，NUS1，SF1，EPB41L5这9个基因可能通过甲基化的作用方式与B-ALL相关。

参考文献

[1]Studies on microRNAs that are correlated with the cancer stem cells in chronic myeloid leukemia.Xishan Zhu;;Ziying Lin;;Jing Du;;Xu Zhou;;Lawei Yang;;Gang Liu.Molecular and Cellular Biochemistry,2014

[2]Differential MiRNA expression in childhood acute lymphoblastic leukemia and association with clinical and biological features.Jaqueline Carvalho de Oliveira;;Carlos Alberto Scrideli;;María Sol Brassesco;;Andressa Gois Morales;;Julia Alejandra Pezuk;;Rosane de Paula Queiroz;;JoséAndres Yunes;;Silvia Regina Brandalise;;Luiz Gonzaga Tone.Leukemia Research,2011

[3]miR signatures and the role of miRs in acute myeloid leukaemia..European Journal of Cancer,2010

[4]Recent Research Advances in Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia.Ching-Hon Pui.Journal of the Formosan Medical Association,2010

[5]石懿玉.5-Aza-CdR对B-ALL细胞系NALM-6的作用及其对miRNA影响的研究[D].山西医科大学,2014.