MALME-3M人恶性黑色素瘤贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

MALME-3M人恶性黑色素瘤贴壁细胞系是一种人类恶性黑色素瘤的体外细胞模型，用于研究该疾病的发生、发展和治疗。该细胞系是由美国国立卫生研究院(NIH)建立的，是从一名患有转移性黑色素瘤的患者身上获取的肿瘤组织进行培养而得到的。

MALME-3M人恶性黑色素瘤贴壁细胞系在形态学上表现为多边形或长方形，具有高度的异质性和增殖能力。它们表达多种与黑色素瘤相关的分子标志物，如酪氨酸酶、S-100蛋白、gp100等。此外，MALME-3M细胞系还表现出对多种化疗药物和靶向药物的不同敏感性，这为临床治疗提供了重要的参考依据。

MALME-3M人恶性黑色素瘤贴壁细胞系已经被广泛应用于黑色素瘤的基础研究和药物筛选等领域。研究人员可以通过对该细胞系的研究来探索黑色素瘤的发生机制、寻找新的治疗靶点以及评估新药物的疗效和安全性等。

MALME-3M人恶性黑色素瘤贴壁细胞系

MALME-3M人恶性黑色素瘤贴壁细胞系培养操作

1)复苏MALME-3M人恶性黑色素瘤贴壁细胞系：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)NCI-H647人非小细胞肺癌贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3)MALME-3M人恶性黑色素瘤贴壁细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

MALME-3M人恶性黑色素瘤贴壁细胞系可以用于基于TRPV4探讨次乌头碱对黑色素瘤转移影响的机制研究

利用TCGA、Cancer Cell Line Encyclopedia以及The Human Protein Atlas数据库确定并选择高表达TRPV4的黑色素瘤作为研究对象。通过数据库调研发现,黑色素瘤细胞系中TRPV4表达较其他肿瘤细胞高,并且患者病灶组织免疫组化结果也显示出TRPV4表达较正常组织高,且患者的预后与TRPV4表达呈负相关。采用Western Blot、免疫荧光进行验证发现,人源黑色素瘤细胞株(A375、Sk-Mel-24、MALME-3M人恶性黑色素瘤贴壁细胞系)TRPV4表达较人上皮细胞(HaCaT)高,其中A375的TRPV4表达水平最高。

通过构建A375 TRPV4-/-细胞确定次乌头碱可以通过TRPV4介导A375细胞钙内流。通过体内外实验发现TRPV4的激动剂GSK1016790A以及“热属性化合物”次乌头碱可以通过TRPV4介导的钙内流促进黑色素瘤A375的转移。通过免疫荧光检测给予次乌头碱之后单细胞悬浮状态下A375细胞的极性,发现次乌头碱可以显著促进A375单细胞极化。

通过构建Ezrin-EGFP的A375细胞,尾静脉注射并观察其在裸鼠肝脏以及肺部血管中的阻滞情况,发现次乌头碱促进A375在裸鼠肝肺部位的阻滞。体内实验注射使用次乌头碱干预后的A375细胞,发现次乌头碱可以通过促进A375极化(单细胞极性)进而促进黑色素瘤A375的转移。通过免疫荧光以及Western Blot检测不同浓度以及不同干预时间次乌头碱对Ezrin磷酸化的影响以及免疫组化检测转移灶部位p-Ezrin的水平发现,乌头碱对于A375细胞极化的影响可能是通过促进Ezrin磷酸化进行调控的。

通过长时程活细胞观察系统观察次乌头碱对A375细胞阿米巴运动的影响,并且进行免疫组化、免疫荧光以及Western Blot检测次乌头碱对Rho/ROCK轴以及MLC磷酸化的影响发现,次乌头碱可以通过Rho/ROCK-MLC信号转导途径促进黑色素瘤细胞通过阿米巴样运动向周围组织侵袭。通过B16F10以及A375的皮下荷瘤实验进一步验证Rho/ROCK/MLC信号轴激活对于黑色素瘤细胞侵袭性的影响。

荧光标记葡聚糖渗漏实验、免疫荧光以及Western Blot检测发现,次乌头碱还可以通过Rho/ROCK/MLC信号轴导致A375细胞的分泌特征改变,最终破坏HUVEC的紧密连接,并且这一作用在其外渗(Extravasate)的过程中可能发挥作用。

[结论与意义]基于以上实验结果最终发现,次乌头碱通过TRPV4介导的钙内流激活ROCK/MLC2信号轴,导致黑色素瘤细胞获得阿米巴运动特征(导致其自身侵袭性增加)以及特殊的分泌特性(导致血管内皮细胞的细胞骨架重构,使得其渗透性增加),使得其从原位到达转移位点之后获得进一步在远端组织形成转移灶的优势。

参考文献

[1]Membrane Flow Drives an Adhesion-Independent Amoeboid Cell Migration Mode.Patrick R.O'Neill;;Jean A.Castillo-Badillo;;Xenia Meshik;;Vani Kalyanaraman;;Krystal Melgarejo;;N.Gautam.Developmental Cell,2018

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[5]丁语石.基于TRPV4探讨次乌头碱对黑色素瘤转移影响的机制研究[D].南京中医药大学,2020.