LS513 人结直肠癌细胞的应用

背景^[1-3]

LS513人结直肠癌细胞是一种从人类结直肠癌组织中分离出来的癌细胞系。这种细胞系在实验室中被广泛用于研究结直肠癌的发生、发展和治疗。

LS513人结直肠癌细胞

LS513人结直肠癌细胞具有以下特点：

形态特征：LS513细胞呈长条形，多边形或不规则形状，具有多个核。它们通常在体外培养时形成单层或多层细胞结构。

生长特性：LS513细胞生长迅速，可以在体外持续传代。它们的增殖速度受到生长因子、细胞密度和其他环境因素的影响。

分子特征：LS513细胞表达多种与结直肠癌相关的分子标志物，如表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)等。这些标志物有助于研究人员了解肿瘤的生物学特性和寻找潜在的治疗靶点。

药物敏感性：LS513细胞对多种化疗药物具有不同程度的敏感性，这为临床试验提供了基础数据。此外，研究人员还可以利用这些细胞来评估新药物的安全性和有效性。

LS513人结直肠癌细胞培养方法：

1、LS513人结直肠癌细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、LS513人结直肠癌细胞复苏：

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

3、LS513人结直肠癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；

④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

应用^[4-5]

LS513人结直肠癌细胞可以用于GDF15表达及其H6D遗传变异与结直肠癌转移和预后关系的研究

1. GDF15表达与结直肠癌转移和预后的关系以及转移机制的探讨我们运用免疫组织化学方法对250例结直肠癌患者肿瘤组织中GDF15蛋白表达水平进行了检测。结果证实GDF15的表达与淋巴转移、远处转移、TNM分期以及肿瘤芽数目正相关,并且GDF15高表达的患者预后差。我们体外模拟旁分泌途径,运用人重组GDF15蛋白对结直肠癌细胞株HT29、SW480及LS513人结直肠癌细胞进行处理来探讨GDF15引起结直肠癌转移的机制。

通过Transwell实验证实,GDF15能够促进HT29细胞和SW480细胞的迁移。在随后进行的信号通路实验中,我们发现,GDF15能使HT29和SW480细胞Smad2/3和磷酸化的smad2/3蛋白水平表达增加。并且,在HT29和LS513人结直肠癌细胞中,Twist和MMP9蛋白表达升高,E-cadherin蛋白表达下降；在SW480细胞中,Twist、MMP9和Vimentin蛋白表达升高,E-cadherin蛋白表达下降。以上结果表明,GDF15促进结直肠癌细胞的迁移是通过EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)过程来实现的。为了进一步验证Twist等EMT标志物表达的改变是否受Smad2/3的调控,运用shRNA干扰技术在HT29细胞和SW480细胞中敲低Smad2或Smad3的表达后,GDF15引起EMT标志物表达改变的效应能够被逆转。该结果说明GDF15引起EMT标志物表达的改变是受Smad2/3调控的。

GDF15是TGF-β超家族成员,而TGF-β是目前最常用于诱导EMT模型的细胞因子,这种诱导作用是通过激活Smad2/3来实现的。当用GDF15作用于细胞后,Smad2/3也被激活。因此,我们设想,GDF15是否也是通过TGF-β通路参与了EMT过程,并引起细胞的迁移。为了验证这种假设,我们运用TGF-β受体特异性抑制剂SB-431542预处理HT29、SW480及LS513人结直肠癌细胞后,再用GDF15作用这些细胞,结果Smad2/3的表达没有增高,E-cadherin的表达也没有出现下降。另外,在SB-431542处理后的HT29和SW480细胞中用GDF15作用后,磷酸化Smad2/3的表达末见增高。这些结果说明GDF15引起EMT标志物表达的改变是通过Smad依赖的TGF-β信号通路来完成的。

2. GDF15 H6D多态性及其突变在结直肠癌临床中的意义我们运用焦磷酸测序的方法对250例结直肠癌患者的肿瘤组织和配对正常组织DNA以及198例正常人群血液DNA的GDF15 H6D多态性位点进行检测,对获得的数据与临床病理特征及预后情况进行综合分析,结果显示：

(1)H6D多态性及其突变与GDF15的表达未见明显相关性。

(2)GDF15 H6D多态性与结直肠癌的发生存在相关性,含有D等位基因的人群是结直肠癌发病的易感人群。

(3)结直肠癌中,GDF15 H6D存在突变,这种突变在CG基因型中更容易发生,有突变的患者死亡率比没有突变的患者要高。

(4) 在男性结直肠癌中,GDF15 H6D发生突变的患者容易发生远处转移,且预后差。

(5) 在结肠癌患者中,GDF15 H6D含D等位基因的患者容易发生远处转移,这类患者死亡率高,纯合的HH基因型预后好。

(6)在直肠癌患者中,有H6D突变的患者容易引起淋巴结转移和高的TNM分期,最后导致死亡的比例增高。

参考文献

[1]Macrophage inhibitory factor 1 acts as a potential biomarker in patients with esophageal squamous cell carcinoma and is a target for antibody‐based therapy.Xiao‐Bing Wang;;Xing‐Ran Jiang;;Xi‐Ying Yu;;Lin Wang;;Shun He;;Fei‐Yue Feng;;Li‐Ping Guo;;Wei Jiang;;Shih‐Hsin Lu.Cancer Sci,2014

[2]Growth Differentiation Factor-15 as Biomarker in Uterine Sarcomas.Jone Trovik;;Helga Birgitte Salvesen;;Tine Cuppens;;Frederic Amant;;Anne Cathrine Staff.International Journal of Gynecological Cancer,2014

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[5]汪静宇.GDF15表达及其H6D遗传变异与结直肠癌转移和预后关系的研究[D].浙江大学,2016.