ChIRP试剂盒

背景^[1-7]

ChIRP（Chromatin Isolation by RNA Purification）试剂盒运用于研究RNA与DNA、RNA及蛋白质之间相互作用的实验。根据研究对象不同，ChIRP技术结合了高通量测序（ChIRP-Seq）和质谱技术（ChIRP-MS）分别研究与目标RNA互作的基因和蛋白质。ChIRP技术是通过设计生物素探针组，通过碱基互补配对将目标RNA特异性拉下的同时会富集与其互作的DNA、RNA或蛋白质（RBPs），最后将基因开展高通量测序或PCR，可以得到该调控RNA转录调控的下游靶基因。

与此同时，RBPs可以开展Western Blot验证或者MS鉴定。ChIRP是研究体内RNA与蛋白互作的有力工具。该技术在特定时间点用甲醛交联等方式固定细胞内RNA与蛋白及核酸的互作复合物，再利用生物素标记的探针及链霉亲和素磁珠纯化出靶RNA及其与它结合的蛋白、核酸复合物，复合物中的蛋白质被洗脱下来western-blot，可以验证某个蛋白是否与靶RNA结合；洗脱下来的蛋白液做质谱鉴定，即可筛选出与目的RNA结合的蛋白。

技术原理：生物素与链霉亲和素间的作用是目前已知强度最高的非共价作用；其中活化生物素可以在蛋白质交联剂的介导下，与已知的几乎所有生物大分子偶联。ChIRP技术利用生物素标记探针识别靶RNA，在纯化靶RNA的同时将与它结合的蛋白也一并纯化出来，洗脱得到靶RNA的结合蛋白质。

实验流程：

1.ChIRP探针设计合成

2.lncRNA复合物交联

3.超声打断

4.探针杂交

5.DNA回收纯化

6.测序分析

ChIRP试剂盒优势：

1.研究与LncRNA或其他染色质相关RNA相互作用的蛋白或DNA。

2.有效的检测与染色质相关的RNA在基因组上的作用位点。

3.高特异性：利用evenodd捕获探针消除非特异信号确保清晰的检测到特异性相互作用。

4.高灵敏性：利用PureProteomeTM Streptavid in6磁珠进行pull down。

5.操作简单方便：试剂盒提供了实验所需要的缓冲液，和试剂。

6.试剂盒中提供阴阳性对照，确保实验顺利进行，实验结果准确。

7.实验获得的染色质可用RT-qPCR,qPCR和二代测序等方法进行检测。

8.实验可获取内源性的lncRNA与染色质的天然复合物，结果更加真实可信。

应用^[8]

ChIRP试剂盒可用于RNA结合蛋白在体内条件下的验证和筛选。

例如在多能干细胞关键因子Oct4 RNA结合蛋白的分离与鉴定中先经高效液相色谱-质谱法鉴定和筛选出121个能与Oct4 3’非翻译区(untranslated region,UTR)和Oct45’UTR相结合的RNA结合蛋白,肽段图谱匹配数≥2的有11个。再培养小鼠胚胎干细胞(R1),从中提取细胞总RNA,反转录为cDNA,PCR扩增Oct4并转录为m RNA。采用链霉素亲和层析和质谱技术筛选候选RNA结合蛋白,采用ChIRP剂盒鉴定候选RNA结合蛋白。

参考文献

[1] Genomic maps of long noncoding RNA occupancy reveal principles of RNA-chromatin interactions.Mol Cell 44(4):667-678(2011).

[2] Chromatin isolation by RNA purification(ChIRP).J Vis Exp(61).(2012)

[3] Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.Cell 161(2):404-416(2015).

[4] Translationally controlled tumor protein interacts with nucleophosmin during mitosis in ES cells[J].Helena Johansson,Dzeneta Vizlin-Hodzic,Tomas Simonsson,Stina Simonsson.Cell Cycle.2010(11)

[5] Role of Npm1 in proliferation,apoptosis and differentiation of neural stem cells[J].Yang Qing,Gao Yingmao,Bing Lujun,Li shaoling.Journal of the Neurological Sciences.2007(1)

[6] Inducible and reversible suppression of Npm1 gene expression using stably integrated small interfering RNA vector in mouse embryonic stem cells[J].Bei Bei Wang,Rui Lu,Wei Cheng Wang,Ying Jin.Biochemical and Biophysical Research Communications.2006(4)

[7] Induction of Pluripotency in Mouse Somatic Cells with Lineage Specifiers[J].Jian Shu,Chen Wu,Yetao Wu,Zhiyuan Li,Sida Shao,Wenhui Zhao,Xing Tang,Huan Yang,Lijun Shen,Xiaohan Zuo,Weifeng Yang,Yan Shi,Xiaochun Chi,Hongquan Zhang,Ge Gao,Youmin Shu,Kehu Yuan,Weiwu He,Chao Tang,Yang Zhao,Hongkui Deng.Cell.2015(5)

[8] 马姬,郭传亮,范书玥,薛燕,曾凡一.多能干细胞关键因子Oct4 RNA结合蛋白的分离与鉴定[J].上海交通大学学报(医学版),2019,39(01):4-10.