TOLEDO人皮肤T淋巴细胞瘤悬浮细胞系的应用

背景^[1-3]

TODOLA人皮肤T淋巴细胞瘤悬浮细胞系是一种从人类皮肤T淋巴细胞瘤组织中分离出来的癌细胞系。这种细胞系在实验室中被广泛用于研究皮肤T淋巴细胞瘤的发生、发展和治疗。

TODOLA人皮肤T淋巴细胞瘤悬浮细胞系具有以下特点：

形态特征：TODOLA人皮肤T淋巴细胞瘤悬浮细胞系呈半透明的圆形或椭圆形，大小不一。它们通常在体外培养时形成单层或多层细胞结构。

生长特性：TODOLA人皮肤T淋巴细胞瘤悬浮细胞系生长迅速，可以在体外持续传代。它们的增殖速度受到生长因子、细胞密度和其他环境因素的影响。

分子特征：TODOLA人皮肤T淋巴细胞瘤悬浮细胞系表达多种与皮肤T淋巴细胞瘤相关的分子标志物，如CD3、CD4、CD8等。这些标志物有助于研究人员了解肿瘤的生物学特性和寻找潜在的治疗靶点。

药物敏感性：TODOLA人皮肤T淋巴细胞瘤悬浮细胞系对多种化疗药物具有不同程度的敏感性，这为临床试验提供了基础数据。此外，研究人员还可以利用这些细胞来评估新药物的安全性和有效性。

TODOLA人皮肤T淋巴细胞瘤悬浮细胞系

TODOLA人皮肤T淋巴细胞瘤悬浮细胞系培养方法：

1、TODOLA人皮肤T淋巴细胞瘤悬浮细胞系传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、TODOLA人皮肤T淋巴细胞瘤悬浮细胞系细胞复苏：

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

3、TODOLA人皮肤T淋巴细胞瘤悬浮细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；

④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

应用^[4-5]

TODOLA人皮肤T淋巴细胞瘤悬浮细胞系可以用于MiRNAs在白癜风外周血单个核细胞中的表达及miR-3940-5p对T细胞作用机制的研究

应用miRCURY LNATM microRNA Array微阵列芯片技术检测非节段型白癜风(Non-Segmental Vitiligo,NSV)患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中microRNAs的表达模式,并筛选其和健康人相比差异性表达的miRNAs。运用实时荧光定量PCR技术对差异性表达的miRNAs进行验证。

体外培养白癜风患者PBMCs,提取miRNA检测胸腺肽Tα1对筛选的miRNA表达变化的直接效应。应用靶基因预测数据库选择白介素2受体作为miR-3940-5p调控的靶基因,构建慢病毒载体抑制miR-3940-5p表达并感染TODOLA人皮肤T淋巴细胞瘤悬浮细胞系进一步研究miR-3940-5p对白癜风免疫相关基因的靶向调节,探讨差异表达的miRNAs和Tα,在非节段型白癜风中的作用机制。

方法第一部分：收集5例进展期非节段型白癜风患者和5例年龄性别相匹配的健康人外周静脉血,分离单个核细胞,提取总RNA。应用第七代miRCURYTMLNA阵列(v.18.0)(Exiqon)芯片杂交技术对NSV患者和健康人PBMCs总RNA进行miRNAs的表达谱系差异分析,运用MEV软件(v4.6,TIGR)进行聚类分析；收集32例进展期NSV患者和18例健康人外周血并提取单个核细胞总RNA,茎环引物法逆转录合成cDNA,通过实时荧光定量PCR技术进行miRNA差异表达验证;体外培养白癜风患者外周血单个核细胞,将不同浓度胸腺肽α.加入细胞悬液,72h后离心收集细胞,提取miRNA进行RT-qPCR分析,检测差异性miRNAs的相对表达量。分析胸腺肽α1对白癜风患者PBMCs中差异性miRNAs表达水平的直接效应。

第二部分：应用生物信息数据库miRDB和Targetscan预测筛选的miRNA-3940-5p可能调控的与白癜风自身免疫相关的靶基因IL-2RG。构建低表达miR-3940-5p慢病毒载体,转染至TODOLA人皮肤T淋巴细胞瘤悬浮细胞系,设立慢病毒阴性对照组；miR-3940-5p表达下调是通过应用预先设计的反义RNA序列竞争结合到miR-3940-5p前体并克隆到GV159载体Hl-MCS-CMV-EGFP来实现的。3-4天后观察绿色荧光蛋白表达阳性的细胞转染率,收获细胞沉淀；通过ELISA和Western Blot技术检测培养的淋巴细胞上清液和细胞中IL-2R Gamma蛋白含量及表达水平,分析miRNA-3940-5p抑制表达对靶基因IL-2RG的调控作用。

参考文献

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[2]Micro RNA profiling reveals differentially expressed micro RNA signatures from the skin of patients with nonsegmental vitiligo.M.S.Mansuri;;M.Singh;;M.Dwivedi;;N.C.Laddha;;Y.S.Marfatia;;R.Begum.Br J Dermatol,2014

[3]Novel alkylphospholipid-DTC hybrids as promising agents against endocrine related cancers acting via modulation of Akt-pathway.Santosh Jangir;;Veenu Bala;;Nand Lal;;Lalit Kumar;;Amit Sarswat;;Amit Kumar;;Hamidullah;;Karan S.Saini;;Vikas Sharma;;Vikas Verma;;Jagdamba P.Maikhuri;;Rituraj Konwar;;Gopal Gupta;;Vishnu L.Sharma.European Journal of Medicinal Chemistry,2014

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[5]王奕.MiRNAs在白癜风外周血单个核细胞中的表达及miR-3940-5p对T细胞作用机制的研究[D].山东大学,2016.