甲酰胺嘧啶-DNA糖基化酶(Fpg)的应用

背景及概述^[1]

Escherichiacoli中存在着一类特异识别 8-羟基鸟嘌呤的修复酶：甲酰胺嘧啶 -DNA糖基化酶，这类酶可以将 8-羟基鸟嘌呤从DNA中清除，以保证细胞遗传信息的稳定性，人与Sacharomycescerevisiae同样存在这类修复酶。Fpg (formamidopyrimidine [fapy]-DNA glycosylase，甲酰胺嘧啶 [fapy]-DNA 糖基化酶）也称作 8-氧代鸟嘌呤 DNA 糖基化酶、甲酰胺嘧啶-DNA糖基化酶(Fpg)，既有 N-端糖基化酶活性也有 AP-裂解酶活性。N-端糖基化酶活性可以切下双链 DNA 上受损的嘌呤碱基，产生一个脱嘌呤（AP）位点。AP-裂解酶活性可以切割 AP 位点的 3´ 或 5´ 端，因此可以除去 AP 位点，产生一个具有 3´ 和 5´ 磷酸的碱基缺口。被 Fpg 识别并切除的受损碱基包括：7，8-二羟基-8-氧代鸟嘌呤（8-氧代鸟嘌呤）、8-羟基腺嘌呤、fapy-鸟嘌呤、甲基-fapy-鸟嘌呤、fapy-腺嘌呤、黄曲霉毒素 B1-fapy-鸟嘌呤、5-羟基-胞嘧啶和 5-羟基尿嘧啶。

特性

甲酰胺嘧啶-DNA糖基化酶(Fpg)具体有下列特点：

1. 单细胞凝胶电泳 (彗星试验)，彗星试验的推荐稀释倍数，1:103～1:104

2. 碱性析出

3. 碱解旋

4. 修饰的切刻平移技术

组分

应用

单细胞凝胶电泳；

DNA损伤和修复研究；

SNP分析。

单位定义

1 单位指在 10 μl 反应体系中，37℃条件下， 1 小时内能够切割 1 pmol 含单个与胞嘧啶配对的 8-氧代鸟嘌呤的 34 bp 寡核苷酸双链所需要的酶量定义为一个活性单位。

反应条件

10 mM Bis-Tris（pH 7.0），10 mM MgCl₂ ，1mM DTT， 100 μg/ml BSA，37℃ 温育

酶储存液

50 mM Tris-HCl (pH 8.0)， 50 mM KCl， 1 mM DTT， 50% Glycerol.

热失活       

60°C 10min。

储存

置于-20°C可保存2年，避免反复冻融。

主要参考文献

[1] 张海涛, 祝其锋. 细胞中特异识别 8—羟基鸟嘌呤的修复酶[D]. , 2001.