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甲酰胺嘧啶-DNA糖基化酶(Fpg)的应用

发布日期:2020/1/20 8:50:27

背景及概述[1]

Escherichiacoli中存在着一类特异识别 8-羟基鸟嘌呤的修复酶:甲酰胺嘧啶 -DNA糖基化酶,这类酶可以将 8-羟基鸟嘌呤从DNA中清除,以保证细胞遗传信息的稳定性,人与Sacharomycescerevisiae同样存在这类修复酶。Fpg (formamidopyrimidine [fapy]-DNA glycosylase,甲酰胺嘧啶 [fapy]-DNA 糖基化酶)也称作 8-氧代鸟嘌呤 DNA 糖基化酶、甲酰胺嘧啶-DNA糖基化酶(Fpg),既有 N-端糖基化酶活性也有 AP-裂解酶活性。N-端糖基化酶活性可以切下双链 DNA 上受损的嘌呤碱基,产生一个脱嘌呤(AP)位点。AP-裂解酶活性可以切割 AP 位点的 3´ 或 5´ 端,因此可以除去 AP 位点,产生一个具有 3´ 和 5´ 磷酸的碱基缺口。被 Fpg 识别并切除的受损碱基包括:7,8-二羟基-8-氧代鸟嘌呤(8-氧代鸟嘌呤)、8-羟基腺嘌呤、fapy-鸟嘌呤、甲基-fapy-鸟嘌呤、fapy-腺嘌呤、黄曲霉毒素 B1-fapy-鸟嘌呤、5-羟基-胞嘧啶和 5-羟基尿嘧啶。

特性

甲酰胺嘧啶-DNA糖基化酶(Fpg)具体有下列特点:

1. 单细胞凝胶电泳 (彗星试验),彗星试验的推荐稀释倍数,1:103~1:104

2. 碱性析出

3. 碱解旋

4. 修饰的切刻平移技术

组分

名称

数量

Fpg (8 U/μl)

100 μl/500 μl

10X Fpg Reaction Buffer

1 ml/1 ml×2

应用

单细胞凝胶电泳;

DNA损伤和修复研究;

SNP分析。

单位定义

1 单位指在 10 μl 反应体系中,37℃条件下, 1 小时内能够切割 1 pmol 含单个与胞嘧啶配对的 8-氧代鸟嘌呤的 34 bp 寡核苷酸双链所需要的酶量定义为一个活性单位。

反应条件

10 mM Bis-Tris(pH 7.0),10 mM MgCl2 ,1mM DTT, 100 μg/ml BSA,37℃ 温育

酶储存液

50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 1 mM DTT, 50% Glycerol.

热失活       

60°C 10min。

储存

置于-20°C可保存2年,避免反复冻融。

主要参考文献

[1] 张海涛, 祝其锋. 细胞中特异识别 8—羟基鸟嘌呤的修复酶[D]. , 2001.

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